Cell Death Differ｜钟华/杨宇团队发现RIPK3通过顺序招募MLKL和RIPK1诱导PANoptosis并驱动趋化因子产生

RIPK3 是程序性细胞死亡的关键调控分子。其经典激活途径依赖于 RHIM 结构域介导的寡聚化与自磷酸化，进而激活 MLKL 以诱导程序性坏死。当激酶活性受到抑制时， RIPK3 则通过 RIPK1-FADD-Caspase-8 轴诱导细胞凋亡。基于此，传统观点认为 RIPK3 的激酶活性决定了下游信号的转换方向。然而，携带激酶失活突变（如 K51A ）的小鼠能够正常存活，且使用低剂量抑制剂完全阻断程序性坏死也并不能有效诱导凋亡。这些现象表明， RIPK3 信号输出的调控机制比以往认知更为复杂。目前， RIPK3 如何决定下游信号输出的具体分子机制仍不明确。

此外， 泛死亡 （ PANoptosis ） 是近年来提出的一种新型细胞死亡方式，整合了程序性坏死、凋亡与焦亡的特征。尽管已有多种受体被报道可诱导 PANoptosis ，但相关证据多依赖于反映细胞群体平均信号的免疫印迹实验，缺乏对下游分子机制的深入解析，也尚未明确 PANoptosis 与其他三种经典细胞死亡方式在分子及细胞水平上的特征差异。因此， PANoptosis 自提出以来一直饱受争议。

近日，上海交通大学医学院附属胸科医院钟华教授 和杨宇博士 团队在Cell Death and Differentiation发表题为 RIPK3 Sequentially Recruits MLKL and RIPK1 to Induce PANoptosis and Chemokine Production 的研究论文，发现RIPK3直接激活可在同一细胞内同时触发程序性坏死、凋亡与焦亡通路，且三条通路之间存在复杂的交叉调控，为PANoptosis的发生提供了直接证据。同时，研究揭示了RIPK3以聚合状态依赖的方式依次招募MLKL与RIPK1并形成以RIPK3为核心的死亡复合物的分子机制。

主要研究发现：

1 、 RIPK3 直接激活诱导同一细胞内 MLKL 磷酸化与 caspase 切割共发生

通过三种独立实验系统（高渗应激、 RIPK3 化学二聚化、 Dox 诱导过表达）及多种细胞类型，免疫印迹均检测到 p-MLKL 与 cleaved caspase-8 、 -3/-7 共发生。细胞死亡 仅被凋亡与坏死抑制剂联合处理完全抑制。免疫荧光证实 p-MLKL 与 cleaved caspase 信号在单细胞内共定位。这些事件严格依赖 RIPK3 ：仅见于异位表达 RIPK3 的细胞，在 RIPK3 敲除的内源表达细胞中缺失。表明 RIPK3 激活可在单个细胞内触发双重信号输出。

2 、 MLKL 与 RIPK1 因对 RIPK3 寡聚态和多聚态的亲和力差异而被顺序招募

免疫共沉淀和时间分辨实验显示， MLKL 先于 RIPK1 被招募至 RIPK3 。活细胞成像与免疫荧光表明， RIPK3 二聚化后形成不断增长的聚合物。分子排阻色谱揭示： MLKL 快速结合低阶 RIPK3 寡聚体，而 RIPK1 仅结合高度多聚化的 RIPK3 。在 RIPK3 主要为寡聚态的早期， MLKL 与之强共定位而 RIPK1 很少；进入高度多聚化阶段后， RIPK1 结合显著增加， MLKL 共定位减少并形成不依赖 RIPK3 的同聚物。据此提出“ Differential-Affinity Stepwise Assembly ”模型。与经典坏死小体相比，该复合物中 RIPK1 掺入水平更低，且在形态、大小、空间组织、组装顺序及蛋白化学计量上均不同。

3 、 RIPK3 启动的 PANoptosis 源于细胞死亡通路间的整合性信号网络与持续串扰

尽管 RIPK3 激酶活性对 MLKL 磷酸化至关重要，但抑制或损伤其活性却能增强 RIPK1 和 caspase-8 向 RIPK3 的招募，进而增加 caspase-3 和 GSDMD 的切割。另一方面， caspase-3 通过切割 RIPK3 负向调控 MLKL 磷酸化；阻断 caspase 活性或敲除 caspase-3 、 caspase-8 、 RIPK1 可消除 RIPK3 切割，并升高 RIPK3 和 MLKL 的磷酸化水平。此外， caspase-3 在 D88 位点切割 GSDMD ，使 p30 片段失活，抑制 GSDMD 介导的膜破裂。这些结果表明，各细胞死亡通路并非独立运行，而是通过广泛串扰维持动态整合的信号系统。

4 、 RIPK3 驱动的 PANoptosis 具有独特形态学与 DAMPs 释放谱

在同一细胞系统中，通过相差和荧光显微镜比较不同死亡方式的形态进程，划分出 PANoptosis 的五个阶段，其形态特征构成独特谱系，无法单纯归为坏死性凋亡、凋亡或焦亡。透射电镜显示，线粒体与核膜等细胞器的结构损伤动力学不同于凋亡和坏死性凋亡。这种独特动力学源于同一细胞内 MLKL 磷酸化与 caspase 切割的共发生，从而解释了线粒体与核 DAMPs 释放增强的现象。

5 、 RIPK3 启动的 PANoptosis 呈现独特的趋化因子释放谱

通过 RNA-seq 、 Luminex 及 qRT -PCR 在小鼠和人类细胞中验证， PANoptosis 以 CXCL1 、 CXCL10 、 CCL2 、 CCL20 上调为特征。机制上， CXCL1 、 CCL2 、 CCL20 由 MLKL 和 RIPK1 共同介导，其中 RIPK1 主导； CXCL10 则完全依赖 RIPK3 – MLKL 轴，但被 RIPK1 强烈抑制。激酶抑制实验表明， MLKL 介导的趋化因子上调依赖 RIPK3 激酶活性，而 RIPK1 介导的效应不依赖其激酶活性。结合 RNA-seq 与化合物筛选，鉴定出 IKK – NF- κ B 轴为 RIPK 依赖的趋化因子产生通路。综上，该趋化因子释放谱不同于任何先前报道的模式。

综上，本研究 揭示了 RIPK3 以聚合状态依赖的方式顺序招募 MLKL 与 RIPK1 ，组装形成 RIPK3-MLKL-RIPK1-FADD-Caspase-8 死亡复合物，从而在同一细胞内同步启动程序性坏死、凋亡与焦亡。同时，阐明了 RIPK3 、 Caspase-8/3 与 GSDMD 之间的交叉调控网络，以及 RIPK1 通过非激酶依赖的 NF- κ B 途径主导趋化因子产生的机制 。该工作为 PANoptosis 的发生提供了直接证据，确立了 RIPK3 作为整合多种程序性细胞死亡的分子平台的地位，并为靶向炎症性细胞死亡的治疗策略提供了新的理论框架。

RIPK3 启动泛死亡的机制模型

上海交通大学医学院附属胸科医院杨宇博士（ 兼 共同通讯作者）、王悦博士、武二鹏博士，以及复旦大学生命科学学院王洋青年副研究员为本文的共同第一作者。上海交通大学医学院附属胸科医院钟华教授、钟润波副教授和周严医师为本文的共同通讯作者。本研究得到了上海交通大学医学院附属胸科医院中心实验室、中国科学院上海分子细胞科学卓越创新中心化学生物学 / 细胞分析技术平台的大力支持。

https://www.nature.com/articles/s41418-026-01737-2

制版人：十一

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