Nat Immunol | “双面人生”——揭示TOX的CD4+ T细胞谱系特异性功能

撰文 |咸姐

T细胞的分化与功能受转录因子的精密调控，其命运取决于抗原遭遇的性质和微环境信号。具体而言，初始CD8+ T细胞在急性感染等免疫激活条件下，可分化为具有细胞毒功能的效应细胞并形成长寿命记忆细胞；而在肿瘤或慢性感染等持续性抗原刺激下，则会进入一种低反应性的"耗竭"状态。相比之下，CD4+ T细胞的分化更为多样，在不同细胞因子环境的驱动下，初始CD4+ T细胞可极化为多种辅助T细胞亚群，包括TH1、TH2、TH17、滤泡辅助T细胞（TFH）和调节性T细胞（Treg）。每个亚群的谱系定型均由特定的"主转录因子"及其调控的效应细胞因子所定义【1,2】。 其中一种对T细胞发育和分化至关重要的特定核转录因子是TOX，其属于TOX家族（包括TOX、TOX2、TOX3和TOX4）的重要成员。该蛋白最初在胸腺细胞发育中被发现，是CD4+胸腺细胞发育、自然杀伤细胞（NK细胞）分化以及固有淋巴细胞（ILC）从共同淋巴祖细胞分化所必需的关键调控因子。在胸腺发育过程中，TOX作为上游调控因子激活ThPOK的表达，从而决定CD4+T细胞谱系的定向分化【3】。目前， TOX在CD8+ T细胞生物学中的功能已被广泛研究，在肿瘤和慢性感染等持续性抗原刺激条件下，CD8+ T细胞中的TOX高表达，并通过上调抑制性受体来介导T细胞耗竭和维持其存活【4】。然而， TOX在CD4+ T细胞中的表达模式、调控机制及其功能意义仍然不甚明确。

近日，来自美国斯隆·凯特林研究所的Andrea Schietinger团队在Nature Immunology上在线发表题为TOX drives CD4+ TH1 effector function, antitumor immunity and autoimmune pathology的文章，系统研究了TOX在外周CD4+ T细胞分化及辅助T细胞命运定型中的作用，发现TOX在小鼠和人类的TH1细胞谱系中均高表达，且是TH1细胞效应功能所必需的，尤其是对于IFNγ的产生至关重要，并且与增强的抗肿瘤免疫、对免疫疗法的响应以及自身免疫性疾病和炎症性疾病中的致病性反应密切关联。研究结果为理解CD4+ T细胞的谱系特异性调控机制提供了新的视角，也为优化基于T细胞的免疫治疗策略提供了理论基础。

为了探究TOX在CD4+ T细胞分化中的作用，研究者通过体外极化实验发现，在小鼠和人类的多种辅助T细胞亚群中，TOX均在TH1细胞中表达水平最高。在PR8流感病毒感染的小鼠模型中，病毒特异性TH1细胞同样高表达TOX，且产生IFNγ的效应TH1细胞亚群中TOX表达尤为显著。进一步的动力学分析显示，TOX在TH1极化后48小时开始表达，早于IFNγ的产生。同时，研究表明，TOX的诱导依赖于TCR信号（需NF-κB、AP1和NFAT协同激活）以及CD28共刺激信号，而IL-12信号虽非TOX诱导所必需，却是IFNγ产生的关键。使用FK506抑制NFAT信号可完全阻断TOX表达和IFNγ产生，证实TOX位于TCR-NFAT信号轴下游。此外，在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）慢性感染和B16-GP61肿瘤模型中，经历持续抗原刺激的抗原特异性CD4+ T细胞同样高表达TOX并维持IFNγ产生，表明在体内慢性炎症和肿瘤微环境中，TOX高表达是TH1细胞的标志性特征并与效应功能密切相关。

为了了解TOX是否对TH1细胞效应器功能起关键作用，研究人员随后进行了功能获得和功能缺失实验。实验结果显示，过表达TOX使得 CD4+ T细胞中IFNγ产生显著增加，而TNF、IL-17A和IL-4等其他谱系细胞因子未受影响，且pSTAT1、pSTAT4和T-bet表达水平无变化，提示TOX可以特异性增强TH1细胞效应功能。此外，通过dLck-Cre系统在TCR转基因SMARTA（TCR SMARTA ）小鼠模型（该小鼠的CD4+ T细胞经过基因工程改造，使其TCR能够特异性识别LCMV的GP61-80表位）中特异性敲除Tox基因，将初始TOX敲除或野生型TCR SMARTA CD4+ T细胞过继转移至B16-GP61荷瘤小鼠体内，发现TOX敲除不影响CD4+ T细胞的激活和增殖，但导致抑制性受体PD-1和LAG3表达下降，更重要的是IFNγ产生能力严重受损，而TNF产生保留。同时，TOX敲除后T-bet表达未受影响，但EOMES、pSTAT1和pSTAT4水平显著降低，且晚期CD4+ T细胞显著减少，提示TOX可能通过STAT信号通路调控TH1细胞效应功能和存活。利用CRISPR-Cas9技术在原代初始CD4+ T细胞中急性敲除Tox并过继转移至荷瘤小鼠，同样证实TOX缺失导致IFNγ产生能力丧失。总之，这些数据揭示了TOX选择性地调节外周CD4+ T细胞中TH1细胞因子IFNγ的产生。

为深入揭示TOX在CD4+ T细胞中驱动TH1效应功能的分子机制， 研究人员 对过继转移至B16-GP61荷瘤小鼠第11天的野生型与TOX敲除TCR SMARTA 细胞进行了多组学分析。转录组分析结果显示，TOX敲除后TH1相关转录因子Stat1、Stat4、Nfatc2、Ets1和效应分子Ifng表达下调，而TCR信号负调控因子Nfkbid等表达上调。ATAC-seq发现，TOX敲除导致Ifng位点附近的关键调控区域——包括远端增强子CNS-34和长链非编码RNA Tmevpg1基因座——染色质可及性丧失，且这些区域高度富集ETS和NF-κB家族转录因子结合基序。为进一步明确TOX的直接靶点，研究人员对来自B16-GP61荷瘤小鼠的表达TOX的CD4+ TCR SMARTA 细胞进行了CUT&RUN分析，发现TOX直接结合于多个IFNγ正向调控基因位点，包括Tmevpg1、Stat4、Stat1、Nfkb1、Nfatc2和Ets1。研究人员还发现。TOX敲除后NF-κB1蛋白水平降低，而NF-κB激动剂可部分恢复IFNγ产生。以上结果表明，TOX通过直接结合并调控多个关键转录调控因子基因位点，协同维持TH1细胞效应分子的染色质可及性和转录活性，从而驱动CD4+ T细胞的TH1效应功能。

以上 数据表明，TOX在CD4+和CD8+ T细胞中可能发挥相反的功能，为此，研究人员比较了两种细胞中TOX调控的转录程序。RNA-seq分析显示，仅139个差异表达基因在两个谱系中重叠，包括共同下调的抑制性受体（Tigit、Pdcd1）和共同上调的TCR信号负调控因子（Nfkbid、Egr2），表明TOX在两个谱系中共同发挥驱动激活和增强TCR信号的核心功能。然而，TOX在CD4+ T细胞中特异性调控TH1细胞因子程序，表现为ETS和NF-κB家族转录因子表达及下游活性显著降低，而CD8+敲除细胞中则表现为E2F家族和Hic1的活性差异。为进一步解析TOX在两种细胞中功能差异的机制，研究人员对肿瘤来源的TOX阳性CD4+和CD8+ T细胞进行了CUT&RUN分析。结果显示，TOX在两种细胞系中共同结合于干细胞相关基因位点，提示TOX在TCR信号下游被诱导后通过抑制干细胞相关基因表达，使T细胞退出初始/干细胞样状态。而在CD4+ T细胞中，TOX特异性结合于Nfatc2及NF-κB信号驱动因子和ETS靶基因等基因位点。这些发现表明TOX通过NFAT、NF-κB、ETS转录因子和STAT信号的协同作用，特异性调控CD4+ T细胞中TH1细胞的IFNγ产生。

最后， 鉴于TOX在人类肿瘤中被定义为CD8+ T细胞耗竭的主转录因子并与免疫治疗抵抗相关，研究人员探究了TOX在人类CD4+ T细胞中是否与增强的抗肿瘤免疫相关。通过对接受免疫治疗的肝细胞癌和膀胱癌患者单细胞RNA-seq数据分析发现，临床应答者中CXCL13+ CD4+ T细胞群富集TOX和IFNG表达，且TOX与IFNG呈正相关，提示TOX+ CD4+ T细胞标记了一群产生IFNγ的细胞毒性CD4+ T细胞亚群，与免疫治疗的良好响应相关。在自身免疫性血管炎患者单细胞数据中，致病性细胞毒性CD4+ T细胞亚群同样高表达TOX和IFNG，且该亚群对CD4 TOX特征的富集程度高于CD8 TOX特征。研究人员还在自身免疫性糖尿病NOD小鼠模型中验证，胰腺中针对杂交胰岛素肽的致病性CD4+ T细胞也高表达TOX并产生IFNγ和TNF。这些结果表明，TOX+ CD4+ T细胞不仅在人类肿瘤中与抗肿瘤免疫和免疫治疗响应相关，也在自身免疫和炎症性疾病中与致病性反应相关联。

综上所述，本研究揭示了TOX在CD4+ T细胞中的全新关键作用——作为TH1细胞分化的核心驱动因子，通过直接调控Stat1、Stat4、Nfkb1及Tmevpg1等基因，维持Ifng位点染色质可及性，从而促进IFNγ产生。与CD8+ T细胞中TOX介导耗竭不同，CD4+ T细胞中TOX驱动效应功能并与抗肿瘤免疫及免疫治疗响应正相关，但也参与自身免疫疾病的致病过程。这一发现重新定义了TOX的生物学功能，为靶向CD4+ T细胞的免疫治疗策略提供了新思路。

https://doi.org/10.1038/s41590-026-02453-2

制版人： 十一

参考文献

1. Kaech, S. M. & Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation.Nat. Rev. Immunol.12, 749–761 (2012).

2. Zhou, L., Chong, M. M. & Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.Immunity30, 646–655 (2009).

3. Aliahmad, P., Seksenyan, A. & Kaye, J. The many roles of TOX in the immune system.Curr. Opin. Immunol.24, 173–177 (2012).

4. Scott, A. C. et al. TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation.Nature571, 270–274 (2019).

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