人源肝类器官实现 100% 成功率，这篇 Nature 怎么做到的

首次建立了人源成年肝细胞类器官（h-HepOrgs）的长期扩增体系，这篇 Nature 论文能教你搞定类器官的相关实验设计[1]。

实验设计的完美闭环

今天分析的这篇文章，主要是想带大家看看顶刊团队是如何从细胞来源突破到多细胞组装、从功能验证到疾病建模，形成一个完美的闭环。

• 文章亮点：首次建立了人源成年肝细胞类器官（h-HepOrgs）的长期扩增体系，并将其与胆管细胞类器官、门静脉间质细胞组装成「人源门静脉肝组装体」，用于模拟肝脏疾病和药物筛选。
  

• 设计思路：细胞来源突破 → 长期扩增验证 → 功能表征 → 多细胞组装 → 疾病建模 → 治疗应用。

• 适用领域：类器官、肝病建模、再生医学。

• 发文思路：「类器官+多细胞组装」。这篇文章的核心亮点不是单纯「造了个肝细胞类器官」，而是将三种细胞类型组装在一起，形成了「肝细胞+胆管细胞+间质」的复合结构，一下子就把模型的生理相关性提升到了新的高度，一下子就做出了新意。

具体实验思路

1、先解决核心挑战：人源成年肝细胞类器官在体外难以长期扩增：

解决方案：优先找到促进肝细胞扩增的条件：研究人员分析了人肝癌类器官和小鼠肝部分切除术后再生肝组织的转录组数据，通过 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）发现 YAP 和 WNT 信号通路在肝细胞增殖中被激活。基于这一发现，他们在原有培养基中添加了 WNT 激动剂（Wnt Surrogate）和 LATS1/2 抑制剂（TRULI）以激活 YAP 信号，成功实现了 h-HepOrgs 的长期传代（>3 个月，>10 代，每周 1:2 传代）。

更进一步地优化：去除烟酰胺（nicotinamide）可使类器官形成效率提高近 10 倍，最终确立了 h-HepOrg 扩增培养基 EM2（MM + WntS + TRULI - Nic）。利用这一体系，研究团队从 28 例患者中 100% 成功建立了 h-HepOrgs，并创建了活体生物库。

2、利用全面的分子表征证明 h-HepOrgs「像真的肝细胞」：

• RNA 测序：比较 h-HepOrgs 与原代人肝细胞（PHHs）的基因表达谱，发现高度相关，而胆管细胞类器官（h-CholOrgs）则单独聚类

• 基因集富集分析（GSEA）：h-HepOrgs 富集了增殖相关基因特征，类似肝部分切除后的再生肝组织

• 免疫荧光：h-HepOrgs 表达 Ki-67 增殖标志物，且 YAP 定位于细胞核（证实通路激活）

• 核型分析：长期培养后染色体数目保持稳定

• 冻存复苏：h-HepOrgs 可冻存复苏而不丧失扩增能力

这些结果表明，h-HepOrgs 保留了原代肝细胞的特征，同时获得了稳定的扩增能力。

3、通过功能实验验证 h-HepOrgs 保留肝细胞关键功能：

• 胆汁小管结构：透射电镜观察显示，h-HepOrgs 形成了类似体内肝组织的胆汁小管结构（细长管腔）

• 白蛋白分泌：ELISA 检测证实 h-HepOrgs 分泌白蛋白

• 药物代谢酶活性：检测 CYP450 酶活性，证实 h-HepOrgs 保留了药物代谢功能

• 移植治疗：将 h-HepOrgs 移植到肝病小鼠模型中，可恢复肝功能和肝小叶结构，证明其体内功能潜力

4、开始做「核心技术创新」：通过多细胞组装构建人源门静脉肝组装体

研究团队将 h-HepOrgs（肝细胞类器官）、h-CholOrgs（胆管细胞类器官，来自同一患者）、人源门静脉间质细胞（原代分离，通过 CD90+PDGFRα+分选富集）三种细胞按特定比例混合培养后，细胞自组装形成了门静脉肝组装体（periportal liver assembloids）。这一结构再现了体内门静脉区域的细胞排布：胆管细胞和间质细胞被包裹在肝细胞实质中，形成了类似体内肝脏门静脉区域的组织学结构。

再通过免疫荧光染色显示，组装体中肝细胞标志物（HNF4α、白蛋白）、胆管细胞标志物（CK7、CK19）和间质细胞标志物（α-SMA、vimentin）呈特征性分布。

5、通过空间转录组学验证组装体再现体内基因表达模式

为了证明组装体「像真的门静脉区域」，研究团队进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析。结果显示：

• 组装体中肝细胞、胆管细胞和间质细胞的基因表达谱与体内相应细胞高度一致

• 组装体中肝细胞富集了脂肪酸代谢、补体、药物代谢等经典肝细胞功能基因

• 门静脉区域特征基因（如 SAA1、SAA2、APOA1）在组装体肝细胞中表达

• 细胞间相互作用相关基因在组装体中被正确激活

这些结果证实，组装体在细胞组成、空间排布和基因表达三个维度上都高度模拟了体内门静脉区域。

6、通过增加间质细胞数量，用组装体模型模拟胆道纤维化

研究团队进一步将组装体用于疾病建模 —— 胆道纤维化。他们通过将门静脉间质细胞数量增加 20 倍（从 25 个增加到 500 个），同时保持其他细胞数量不变，构建了「纤维化样组装体」：

• 胶原沉积和基质相关基因表达显著增加

• 胆管细胞数量增加，呈现增殖表型（Ki-67 阳性）

• 肝细胞数量减少，伴随凋亡增加

• 炎症相关基因（TNF 信号、IL-4/IL-6、NF-κB、JAK-STAT）在肝细胞中富集

• TGF-β 信号通路在肝细胞和胆管细胞中均被激活

• 部分肝细胞表达胆管细胞标志物 KRT19，提示可能的转分化

这些表型与临床胆道纤维化患者（如原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性胆管炎）的转录组特征高度一致，为药物筛选提供了「类器官层面」的疾病模型。

主要结果

1、成功建立了可长期扩增的人源成年肝细胞类器官（h-HepOrgs）

从 28 例患者中 100% 成功建立 h-HepOrgs，可长期传代 >3 个月（>10 代），建立了活体生物库。关键突破在于：通过激活 YAP 和 WNT 信号通路，突破了人源成年肝细胞体外扩增的技术瓶颈。

2、h-HepOrgs 保留了原代肝细胞的分子特征和功能

RNA-seq 显示 h-HepOrgs 与原代肝细胞的基因表达谱高度相关，保留了胆汁小管结构、白蛋白分泌和药物代谢功能。移植实验证实其在体内可重建肝功能。

3、成功构建了人源门静脉肝组装体，再现体内组织排布

通过将 h-HepOrgs、h-CholOrgs 和门静脉间质细胞共培养，构建了包含三种细胞类型的复杂组装体，再现了体内门静脉区域的组织学排布和细胞互作。

4、组装体可用于模拟胆道纤维化和药物筛选

增加门静脉间质细胞数量可诱导组装体发生纤维化反应，表现为胶原沉积、胆管细胞增殖、肝细胞凋亡和炎症反应。这些表型与临床胆道纤维化患者高度一致，为抗纤维化药物筛选提供了新平台。

5、患者来源的组装体保留了供体特异性特征

不同患者来源的 h-HepOrgs 和组装体保留了供体特异性的基因表达谱，包括与肝脏疾病易感性相关的基因（如肝炎病毒感染的 IL1RL1 和 ERAP2、肝癌的 GPC3 等），为个性化疾病建模和药物筛选提供了可能。

小编点评

这篇文章最值得借鉴的是它的实验设计逻辑：

第一，不是单纯「造了个肝细胞类器官」，而是系统解决了人源成年肝细胞体外扩增这一难题。通过转录组数据驱动发现 YAP+WNT 激活方案，这种「组学引导」的策略值得借鉴。

第二，通过 RNA-seq、免疫荧光、电镜、移植实验多维度证明类器官，这种多模态验证是顶刊的标配，也是说服审稿人的关键。

第三，不是满足于单一细胞类型，而是将三种细胞类型组装成复合结构，再现了体内门静脉区域的细胞排布和互作。从「单细胞类器官」到「多细胞组装体」，是类器官领域的重要发展方向。

第四，不仅构建了健康状态的模型，还通过增加间质细胞数量诱导纤维化表型，实现了从「生理模型」到「病理模型」的跨越。这种「模型构建 → 疾病建模」的闭环，大大提升了研究的转化价值。

第五，移植实验证实 h-HepOrgs 可在体内重建肝功能，这是再生医学应用的直接证据，为肝衰竭患者的细胞治疗提供了新思路。

第六，从类器官培养技术，到多组学分析，到基因编辑，到活体移植，到疾病建模，每个技术都服务于回答问题，不是为了用技术而用技术。

对于时间有限或不熟悉多组学分析的研究者，这套「多细胞组装+多组学验证+多模态表征」的设计范式值得反复推敲。它将类器官研究从「单细胞模型」推向「多细胞互作系统」，从「生理观察」升级为「疾病模拟」，让模型的生理相关性和临床转化价值提升到了新的高度。

[1]. Yuan L, Dawka S, Kim Y, et al. Human assembloids recapitulate periportal liver tissue in vitro. Nature. 2026;650(8101):438-449. doi:10.1038/s41586-025-09884-1