Nat Biotechnol | 一面镜子照亮细胞“微观宇宙”：章永登团队开发me4Pi-SMLM技术实现纳米级三维成像

光学显微镜的发展是生命科学研究的基石。然而，传统光学显微镜受制于阿贝衍射极限，其分辨率难以满足在分子层面解析细胞精细结构与动态过程的需求。超分辨荧光成像技术的出现突破了这一物理屏障，使在纳米尺度对细胞进行原位、精确定量研究成为可能。其中，单分子定位显微镜（Single-Molecule Localization Microscopy,SMLM）凭借其卓越的空间分辨率和单分子灵敏度，已成为探索纳米尺度亚细胞结构的重要工具。然而，该技术长期面临一个瓶颈：传统三维SMLM（3D-SMLM）存在分辨率各向异性问题，轴向分辨率通常较横向分辨率低2–3倍。为提升轴向性能，基于双物镜的4Pi单分子定位技术（4Pi-SMLM）通过两个相对放置的物镜实现相干检测，可将轴向定位精度提升约5倍，获得10–15纳米的三维各向同性分辨率，并支持在全细胞尺度上对多目标进行成像。尽管如此，4Pi-SMLM的广泛普及仍受限于其仪器结构复杂、对准要求严苛以及高昂的系统成本与维护费用。目前全球仅约10余套此类系统运行于顶尖研究机构，且通常需要专人维护。因此，领域内迫切需要一种既能保持4Pi精度，又兼具低门槛、高稳定性与易用性的新型干涉成像方案。

2026年3月31日，西湖大学章永登团队在Nature Biotechnology期刊上发表题为Mirror-enhanced 4Pi single-molecule localization microscopy with one objective enables isotropic nanoscale imaging的研究论文。该研究开发了一种基于单物镜和反射镜的干涉单分子定位显微技术（简称me4Pi-SMLM，即镜面增强干涉单分子定位显微镜），在细胞样品中实现了2–3纳米的三维各向同性定位精度，性能与传统的双物镜4Pi-SMLM相当，同时显著降低了系统复杂度、维护难度与硬件成本，为纳米尺度生物成像提供了一个易用、稳健的新平台。

me4Pi-SMLM的核心创新在于采用单高数值孔径物镜配合一面位于样品上方的反射镜，取代了传统的双物镜架构。激发光经物镜和样品后被反射镜反射，形成轴向驻波干涉图案；借助快速压电促动器对反射镜进行毫秒级平移，顺序采集三幅相位调制图像（相位步进2π/3），实现自参考干涉定位（图1a）。该设计使me4Pi-SMLM达到2–3纳米的三维定位精度，相较传统3D-SMLM轴向精度提升约5倍（图1c-d）。相较于传统4Pi-SMLM，me4Pi-SMLM完全消除了上行光路，无需昂贵的物镜配对与复杂的双物镜对准；同时，自参考干涉模式对机械漂移具有较低的敏感性，显著降低了光路重校准频率。这些特点共同提升了系统的稳定性，降低了控制复杂度、维护难度与硬件成本，使日常运行更为可靠，有效降低了应用门槛。

图1 me4Pi-SMLM原理与性能验证。

为验证me4Pi-SMLM在生物样品中的成像性能，研究团队采用ALFA-tag/NbALFA体系与speed-optimized DNA-PAINT技术相结合的标记策略，对多种亚细胞结构进行成像。该策略在解决光漂白问题的同时有效减小了标记尺寸。在对微管的成像实验中，相较于3D-SMLM，me4Pi-SMLM增强的轴向分辨率能更有效地解析单个和成束微管的中空环状结构。对发光超过10帧的单分子进行统计分析显示，me4Pi-SMLM在光子数约5,500的细胞环境中实现了2–3纳米的三维定位精度。

核孔复合物（Nuclear Pore Complex, NPC）是具有高度有序对称结构的蛋白复合体，其结构特征使其成为定量超分辨成像中公认的基准模型。人源NPC由约30种不同蛋白质组成，其中结构蛋白Nup96以八重对称的双环形式排列：每个NPC包含32个Nup96拷贝，每个环由16个拷贝组成，相邻分子间的轴向距离约3纳米、横向距离约10纳米。本研究使用me4Pi-SMLM对U-2 OS细胞Nup96-ALFA敲入细胞系进行成像，清晰分辨了NPC的双环结构，轴向截面相较3D-SMLM展现出更优的解析能力。通过平均算法对500个NPC进行三维重构，me4Pi-SMLM解析出Nup96的32个拷贝及相邻蛋白，成像质量与4Pi-SMLM及MINSTED技术相当，证明其三维分辨率优于10纳米。

内质网（ER）是具有复杂三维形态的细胞器，包含管状与片层状结构。me4Pi-SMLM对COS-7细胞内质网的成像显示，其呈现为直径60–100纳米的中空管状网络，以及厚度仅30–50纳米的片层结构，后者是传统超分辨技术较难分辨的结构。

传统4Pi-SMLM因系统复杂度高、稳定性要求严苛，一直难以应用于活细胞成像。me4Pi-SMLM凭借简化的光路、增强的稳定性及对标准共聚焦培养皿的兼容性，首次将4Pi级精度应用于活细胞成像。研究以染料PA-JF549-HaloTag标记U-2 OS细胞系内质网结构，以9毫秒周期时间进行me4Pi-SMLM成像，连续采集10分钟捕捉内质网动态变化。成像结果以三维40–60纳米的分辨率清晰呈现了细胞外周内质网管状网络的动态过程。研究进一步将me4Pi-SMLM应用于三维单分子追踪，使用更低染料浓度和脉冲激活维持适宜的Sec61β单分子密度，以三维6纳米定位精度与9毫秒时间分辨率，揭示了局限于内质网膜内、具有不同迁移率的Sec61β单分子活动。

使用传统4Pi-SMLM对组织样本进行超分辨成像面临重大挑战：组织中的折射率不均匀性、散射及深度依赖的像差会破坏干涉所需的相位关系，降低成像质量。me4Pi-SMLM采用与单物镜3D-SMLM相当的探测配置，对组织成像具有更好的适应性。研究首先在30微米厚小鼠脑切片中对不同深度处的线粒体外膜蛋白和光遗传学关键蛋白Channelrhodopsin-2（ChR2）进行成像。在整个组织体积内，观察到了线粒体的多种形态和沿轴突分布的ChR2簇。在约20微米成像深度内，系统维持了约6纳米的DAFL三维定位精度与优于15纳米的FRC分辨率。

me4Pi-SMLM在多种复杂生物样品中均展现出纳米尺度的成像性能，将4Pi技术的应用范围拓展至活细胞动态成像、单分子追踪与厚组织成像。该技术兼容DNA-PAINT、dSTORM等多种单分子成像模式，成像质量与传统双物镜4Pi-SMLM相当，为纳米尺度的原位生物学研究提供了高精度的观测手段。在保持高性能的同时，me4Pi-SMLM大幅简化了系统架构和控制的复杂度，提升了系统的稳定性、样品适配性，并降低了硬件成本与维护门槛。值得注意的是，me4Pi-SMLM具备良好的升级兼容性：现有3D-SMLM系统仅需增加一面反射镜与一台压电促动器即可完成改造，无需深厚的干涉成像专业技能或高额资金投入。这一特性使原本局限于少数顶尖实验室的4Pi级精度成像技术，有望走向更广泛的生物学研究群体。me4Pi-SMLM为在完整细胞及组织环境中解析纳米尺度的分子结构与动态过程提供了新的工具。

西湖大学章永登研究员为本论文通讯作者，其团队博士生于紫荆和助理研究员郑贝博士为共同第一作者。助理研究员陈艳琴博士，博士生黎舒馨、韦宗仿，访问学生王旭龙，科研助理占雅静、代秋阳、赵文渲为本研究做出重要贡献。本工作获得西湖大学俞晓春研究员及其博士生陈琳琳、西湖大学刘长亮研究员及其博士生唐嘉欣、西湖大学何灵娟研究员及其博士生夏天畅、西湖大学吴旭冬研究员的支持与帮助。

章永登团队（https://www.westlake.edu.cn/faculty/yongdeng-zhang.html）长期致力于开发下一代超分辨率荧光显微成像技术，包括4Pi-SMS、4Pi-SIM、4Pi-SIMFLUX及me4Pi-SMLM等，为在纳米尺度阐明亚细胞结构与动态提供系统性工具。实验室长期招收博士后、科研助理及博士研究生，欢迎具有生物医学工程、物理光学、计算机、生物技术、生物化学等相关专业背景的申请者加入。要求具备良好的学习能力、独立工作能力和团队沟通能力。

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