Nature Commun｜浙江大学许军/李学坤揭示抗癌老药放线菌素D如何“卡住”基因转录的喉咙

短串联重复序列（STRs）占人类基因组的6%，它们的转录异常与60多种疾病密切相关，包括肌萎缩侧索硬化、亨廷顿舞蹈病、强直性肌营养不良1型以及多种癌症。这些STRs的转录会产生毒性RNA，通过形成核内聚集体捕获关键RNA结合蛋白，或通过非经典翻译产生毒性蛋白，最终导致神经元功能紊乱。放线菌素D（ACTD）是首个获批临床应用的抗癌抗生素，六十年来一直用于治疗多种儿童恶性肿瘤，近年研究发现它能抑制与强直性肌营养不良1型相关的CTG重复序列转录，展现出治疗神经退行性疾病的潜力。然而，ACTD的高毒性限制了其临床应用，人们对其如何抑制真核RNA聚合酶II转录的分子机制仍知之甚少。

2026年3月17日，浙江大学医学院附属儿童医院李学坤教授与浙江大学转化医学研究院许军研究员联合团队在《Nature Communications》发表了题为“Stepwise transcription stalling by the anti-cancer drug Actinomycin D and insights into short tandem repeat transcription inhibition”的研究论文。该研究通过重构酵母和哺乳动物转录系统，首次揭示了ACTD诱导RNA聚合酶II在三个不同状态逐步停滞的分子机制，并解析了ACTD与CTG重复序列相互作用的高分辨率结构。

研究团队首先利用重构的体外转录系统发现，ACTD并非均匀地抑制所有GpC位点，而是在EGFR基因的GC富集序列中诱导聚合酶在特定位置停滞。当使用含有单个高亲和力TGCA基序的DNA模板时，ACTD能完全阻断转录延伸，聚合酶主要在结合位点上游的n-5、n-2和n-1三个位置停滞，其中n-1是主要停滞位点。通过突变实验证实，这些多重重叠的停滞条带反映了单个ACTD分子被聚合酶逐步接近的不同阶段。

通过单颗粒冷冻电镜技术，研究人员解析了ACTD诱导聚合酶停滞的三个高分辨率结构。在n-5位置的“遭遇复合物”结构中，ACTD的吩噁嗪酮环插入+6和+7核苷酸之间，其α环与Rpb1亚基switch-1基序的氨基酸残基靠近，这是聚合酶首次感知到ACTD存在的瞬间。在n-2位置的“接合复合物”结构中，ACTD插入+4和+5之间，此时switch-1基序的T1385、R1386和H1387分别与ACTD的α环和β环发生直接相互作用。

在n-1位置的“阻滞复合物”结构中，ACTD插入+3和+4之间，与聚合酶形成更为广泛的相互作用网络：K1102与α环形成氢键，switch-1基序的R1836和H1387与β环形成氢键，桥螺旋的Y836和switch-1的T1385分别与α环和β环形成疏水相互作用。Y836的体积效应和多重相互作用共同阻止ACTD跨越桥螺旋，从而完全阻断聚合酶的前进。

ACTD的结合显著改变了下游DNA的构象。在n-5结构中，ACTD将模板链向主通道推移约11.4Å；在n-2结构中，主要将非模板链推移约10.5Å；而在n-1结构中，对两条链产生均衡的推移作用。DNA结构参数分析显示，ACTD显著改变了被覆盖区域的roll角和twist角。更重要的是，ACTD诱导的DNA构象变化破坏了DNA与switch-1基序及Rpb5 jaw结构域的相互作用。TFIIS切割实验证实，ACTD确实能诱导聚合酶发生回溯，这是导致持久性停滞的关键机制。

这种转录抑制机制在进化上高度保守。使用与人类聚合酶序列同源性超过99%的牛Pol II进行的实验显示，ACTD诱导出与酵母完全一致的停滞模式，n-1同样是最主要的持久停滞位点。2.6Å分辨率的牛Pol II-ACTD复合物结构证实，从聚合酶的移位状态、下游DNA构象到ACTD与聚合酶之间的精细相互作用，所有关键特征都与酵母系统惊人地一致。

针对五种疾病相关的GC富集STRs的系统评估显示，ACTD表现出显著的亚型选择性抑制效应。对于引起强直性肌营养不良1型的CTG重复和亨廷顿舞蹈病的CAG重复，0.1μM的ACTD就能抑制约80%的转录；而对于引起脆性X相关震颤/共济失调综合征的CGG重复、强直性肌营养不良2型的CCUG重复以及肌萎缩侧索硬化的GGGGCC重复，则需要十倍高的浓度才能达到类似抑制效果。这种选择性差异与ACTD的DNA结合亲和力直接相关。

以CTG重复为模型，研究发现ACTD对聚集的重复序列具有加合性抑制效应。当模板中含有两个或三个ACTD结合位点时，相同浓度的ACTD表现出显著更强的抑制效果，形成的抑制复合物也更为稳定。冷冻电镜结构揭示，两个ACTD分子之间通过肌氨酸和甲基缬氨酸侧链形成两对范德华相互作用，三个ACTD分子之间则形成更复杂的疏水相互作用网络。这些分子间相互作用提供了额外的稳定性，解释了为什么更低浓度的ACTD就能有效抑制含有聚集结合位点的STRs转录。值得注意的是，第一个ACTD深埋于聚合酶主通道中，第二个被部分覆盖，而第三个几乎不与聚合酶相互作用，这种差异化的结合模式解释了第三个ACTD对转录抑制贡献较小的原因。

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