跑步机运动通过下调MMP12调节小胶质细胞极化改善脑缺血损伤

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在全球范围内，中风是第二大死亡原因和第三大死亡和残疾原因。从1990年到目前，每年的中风和死于中风的人数大幅增加。目前，静脉溶栓和血栓切除再通是缺血性中风超急性期的一线治疗选择。本研究旨在探讨运动训练与脑缺血后炎症反应之间的关系。通过转录组测序，我们发现跑步机运动可以显著降低MMP12的表达，主要是在小胶质细胞，对神经元的影响很小。因此，这一方法的重点将放在小胶质细胞M2转化、MMP12信号转导和运动后卒中大鼠的神经功能恢复上。

1.跑台运动改善MCAO后神经行为功能和缩小脑梗塞体积

为了评价跑步机运动的神经保护作用，在特定的时间点评估神经功能恢复和脑梗塞体积。实验示意图如图1a所示。与MCAO组相比，MCAO+运动(ME)组在MCAO后7天或14天的平衡木试验、前肢放置试验、改良粘合剂去除试验和转角试验中的神经学评分均高于MCAO组(图1C-F)。此外，与MCAO后7天相比，ME组在14天时的平衡木测试明显改善(图1C)。这些结果表明，跑步机运动改善了中风后大鼠的神经行为功能。TTC染色显示MCAO大鼠脑实质组织学损害。如图1G所示，ME组的脑梗塞体积小于MCAO组。

综上所述，这些数据表明，跑步机运动可以改善MCAO后的神经行为功能，减少脑梗塞体积。

图1 跑步机运动改善大鼠中风后的功能恢复并减少脑梗塞体积。

2.MCAO后跑步机运动将小胶质细胞极化转换为M2表型

为了确定运动后梗死灶周围皮质小胶质细胞的激活亚型，分别对Iba1(小胶质细胞生物标志物)和CD68(M1型标志物)或CD206(M2型标志物)进行双重免疫荧光染色。第7天，脑梗死组梗死灶周围皮质CD68+小胶质细胞数明显多于ME组(图2A和B)，而ME组CD206+小胶质细胞数明显多于MCAO组(图2C和D)。

图2 MCAO后跑台运动将小胶质细胞极化转换为M2表型。

采用定量聚合酶链式反应分析与M1/M2表型相关的表面标志在梗死灶周围皮质的表达。结果显示，在第7天，ME组的促炎因子(IL-1β、CD68)显著降低，而IL-6和TNF-α无明显变化(图3A)。除Arg-1外，ME组的抗炎因子(TGF-β、IL-10、CD206)均较MCAO组上调(图3B)。此外，跑步机运动可以促进日益增长的趋势。在第14天，ME组的所有促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、CD68)显著降低，而所有抗炎因子在ME组显著升高(图3D)。

综上所述，这些数据提示，在MCAO后，跑台运动可以将小胶质细胞的极化从M1转变为M2表型。

图3 与M1/M2表型相关的表面标志物在梗死灶周围皮质的表达。

3.运动减少MCAO后小胶质细胞MMP12的表达，但不影响神经元MMP12的表达

接下来，为了探讨跑步机运动对卒中后炎性微环境影响的具体机制，我们在1周的跑台运动中进行了跨脚本测序分析。图4A展示了热图分级聚类，其提供了针对每组差异表达的基因的可视化表示。在321个DEGs中，87个上调，234个下调(图4B)。我们发现，在GO分析中，多种免疫和炎症相关过程得到了丰富(图4C)，这表明免疫反应在运动训练对中风的影响中发挥了关键作用。GO分析中最显着下调的基因MMP12参与了多种免疫系统的过程，引起了我们的注意。

图4 1周跑台运动转录组测序分析。

采用定量聚合酶链式反应和Western印迹法进一步分析梗死灶周围皮质中MMP-12的表达水平。结果表明，运动后7天MMP-12的表达显著降低，这种作用逐渐增强，并持续到14天(图5A-C)。以往的研究表明，在缺血大鼠脑内表达的MMP-12主要定位于神经元和小胶质细胞，部分定位于寡树突状细胞，不定位于星形胶质细胞，这与我们的研究结果一致。因此，我们随后的研究旨在证实跑步机运动是否主要降低了特定类型神经细胞中MMP-12的表达。通过免疫荧光共标记分析，我们观察到ME组小胶质细胞中MMP-12的表达低于MCAO组(图5F和G)，而在神经元中的表达没有显著差异(图5D和E)。综上所述，我们的研究结果表明，在MCAO后，跑台运动可显著降低小胶质细胞中MMP-12的表达，但对神经元中MMP-12的表达无明显影响。

图5 运动减少MCAO后梗死灶周围皮质MMP12的表达，尤其是小胶质细胞

4.MMP12抑制OGD/R后小胶质细胞极化向M2表型转变

为了探讨MMP12对小胶质细胞极化的影响，我们采用原代小胶质细胞OGD/R模型模拟MCAO大鼠的小胶质细胞状态。我们发现，与对照组相比，原代小胶质细胞中MMP12的表达在OGD后随时间延长而增加，尤其是在8h和12h(图6A)。低氧暴露4h后，小胶质细胞中MMP12的表达逐渐增加，随后在早期(6h、12h)随复氧时间的延长而增加。有趣的是，复氧12h后，MMP12的表达达到峰值后开始下降(图6B)。直到复氧24 h，MMP12的表达仍显著高于复氧0 h。然后，我们向OGD小胶质细胞中加入MMP408，一种特异性的MMP12抑制剂。我们发现80 nM的MMP408能显著降低OGDR小胶质细胞中MMP12mRNA和蛋白的表达(图6D和E)。

图6.OGD/R和MMP408抑制原代小胶质细胞MMP12的表达后，MMP12的mRN

因此，我们选择80 nM的浓度进行后续实验，我们发现MMP408显著增加了CD206+小胶质细胞，但对CD68+小胶质细胞几乎没有影响(图7A-D)。同样，与二甲基亚砜处理组相比，MMP408处理组小胶质细胞的抗炎因子(TGF-β、IL-10、Arg-1、CD206)显著增加，而促炎因子(IL-1β、IL-6、CD68)无明显变化(图7E和F)。这些数据表明抑制MMP12可以将小胶质细胞转变为抗炎的M2型。

图7.抑制MMP12使OGD/R后小胶质细胞的极化向M2表型转变。

5.MMP12抑制OGD/R后小胶质细胞的吞噬功能

为探讨MMP12在小胶质细胞吞噬功能中的作用，用MMP408处理OGD/R小胶质细胞，通过共聚焦显微镜观察小胶质细胞吞噬荧光小球的情况。与对照组相比，OGD/R组被小胶质细胞吞噬的荧光珠没有明显变化(图8A)。但加入MMP408后，小胶质细胞吞噬的乳胶珠要多得多(图8A)。接下来，我们在荧光显微镜下对被小胶质细胞吞噬的荧光小球进行了计数，数据显示，MMP408处理的OGD/R小胶质细胞吞噬两个以上乳胶小球的数量比DMSO处理组多，而含有低于两个乳胶小球的小胶质细胞数量减少(图8B)。提示MMP12抑制剂可提高OGD/R后小胶质细胞的吞噬能力。

图8 抑制MMP12可增强OGD/R后小胶质细胞的吞噬功能。

结论

在本研究中，我们证明了跑台运动可以改善脑缺血再灌注损伤，并促进小胶质细胞向M2表型转变。通过转录组测序，我们发现跑步机运动可以显著降低MMP12的表达，主要是在小胶质细胞，对神经元的影响很小。此外，我们还发现在原代小胶质细胞中抑制MMP12可以使小胶质细胞向M2表型转变，并增强吞噬能力。

在该研究中，研究人员使用了赛昂斯大小鼠跑步机（Sansbio，SA101）来进行实验操作。

SA101Pro 大小鼠跑步机

大小鼠跑步机主要用于小鼠、大鼠及其他动物的训练和新陈代谢研究，使用它可以让动物的训练量化更加准确；同时，小动物跑步机又是动物体能、耐力、运动损伤、运动营养药物、运动生理和病理等研究的必要实验设备。

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