改造5个位点，让H5血凝素更稳定，疫苗保护力大幅提升

摘要：高致病性H5N1禽流感的2.3.4.4b分支近年传播范围持续扩大，跨物种感染风险攀升。我团队针对该毒株血凝素（HA）稳定性差的问题，引入5个突变构建出稳定化H5-FMLMI。冷冻电镜显示突变通过形成疏水相互作用维持HA结构，小鼠实验中，稳定化HA无论以蛋白还是mRNA-LNP形式递送，都能诱导更高滴度的血凝抑制和中和抗体，还能将抗体应答聚焦到受体结合位点，mRNA-LNP疫苗更能实现对H5N1攻击的完全保护，为禽流感大流行防控疫苗研发提供了新方向。

一、H5N1的威胁，藏在不稳定的HA里

高致病性H5N1禽流感从1996年开始大规模传播，2021年2.3.4.4b分支成为全球优势毒株，2024年更是在美国造成奶牛和家禽的大规模疫情，还出现了人类感染病例。这类毒株能感染海狮、狐狸等多种哺乳动物，跨物种传播的能力让人警惕。更关键的是，H5N1的HA蛋白比季节性流感的更不稳定，膜融合的pH值更高，现有灭活疫苗的免疫原性也偏弱，这成了疫苗研发的一大卡点。其实之前也有研究找到过HA稳定化突变，但这些突变在体内对免疫原性的影响，一直没被彻底摸清。

图1 稳定化突变提升H5的热稳定性并减少内部定向单克隆抗体的结合

二、5个突变，给H5 HA装上“稳定器”

我们从过往研究中筛选突变组合，最终在HA2结构域引入H355F/K380M/R397M/L418I/E432L5个突变，命名为H5-FMLMI。用纳米差示扫描量热法检测，pH8.0时H5-FMLMI-foldon的解链温度达77.8℃，而野生型只有55.6℃，低pH下的稳定性也大幅提升。蛋白纯化后发现，稳定化突变让HA三聚体的闭合性更好，能显著降低识别开放三聚体的FluA-20抗体结合，说明三聚体构象更稳定了。

三、冷冻电镜揭秘：稳定化的核心是疏水相互作用

为了弄清楚突变的作用机制，我们解析了H5-FMLMI-foldon的3.2Å冷冻电镜结构。对比野生型HA，两者的茎区和受体结合位点（RBS）的结构偏差极小，这意味着突变没破坏关键的抗原表位。仔细分析发现，5个突变能在HA内部形成新的疏水相互作用，比如R397M用疏水作用替代了原本的极性相互作用，H355F则把pH依赖的离子作用换成了疏水接触，这些相互作用就像“粘胶”，把HA的结构牢牢固定住。

图2 冷冻电镜显示稳定化突变通过形成疏水相互作用稳定H5-FMLMI-foldon

四、小鼠实验：稳定化HA的免疫应答全面升级

我们在BALB/c小鼠中测试了稳定化HA的蛋白疫苗和mRNA-LNP疫苗，免疫方案为0周初免、4周加强。初免后2周，稳定化纳米颗粒和膜锚定HA组的TX24结合滴度，就显著高于未稳定化的对照组。加强后6周，mRNA-LNP递送的稳定化纳米颗粒，诱导的血凝抑制（HAI）滴度是所有组别中最高的，中和抗体滴度也同步提升，就连对异源株IN05，也能诱导更多有功能的中和抗体。

图3 稳定化H5疫苗在小鼠中诱导更强的抗体应答

五、抗体应答的“重定向”：从非中和位点到RBS

用负染电镜多克隆表位作图（ns-EMPEM）分析抗体结合位点，发现所有组别中HA的E位点都是免疫优势位点，但未稳定化HA诱导的抗体，很多靶向三聚体界面的内部表位，甚至会结合单体HA。而稳定化HA能显著减少这类非中和抗体，让更多抗体靶向受体结合位点（RBS）。深度突变扫描（DMS）也证实，稳定化HA诱导的中和抗体，主要靶向RBS附近的A、B表位，这也是中和活性提升的关键原因。

图4 ns-EMPEM显示稳定化突变推动抗体应答靶向RBS

图5 DMS证实稳定化HA诱导的中和抗体主要靶向RBS

六、mRNA-LNP疫苗：稳定化HA实现完全保护

我们用5倍TCID50的TX24株H5N1攻击免疫后的小鼠，观察14天的体重变化和存活率。未稳定化的纳米颗粒组有1只小鼠死亡，平均体重下降7.2%，而稳定化纳米颗粒组和膜锚定HA组（无论是否稳定化），小鼠体重无明显下降，实现了100%的存活率。空LNP对照组的小鼠则全部死于感染，这个结果和之前的HAI、中和抗体数据完全吻合，证明稳定化HA能转化为实际的体内保护力。

图6 稳定化H5 mRNA-LNP疫苗保护小鼠抵御H5N1攻击

七、不止是稳定，这些细节值得琢磨

坦白讲，这次的实验也让我发现了不少有意思的点。mRNA-LNP递送的疫苗，免疫原性整体不输甚至优于蛋白疫苗，尤其是稳定化纳米颗粒的HAI滴度，比蛋白形式高了不少。另外，RC_I_1纳米颗粒支架本身稳定性偏弱，但稳定化HA能弥补这个缺陷，让疫苗仍有良好效果，要是换个更优的支架，效果可能会更好。不过小鼠的免疫应答和人类还是有差异，比如B细胞受体库不同，后续还需要在更接近人类的模型中验证。

八、给禽流感疫苗研发的一点启发

这次的研究证实，给H5 HA加上稳定化突变，是提升疫苗效果的有效策略。这5个突变能在不同疫苗形式（蛋白、mRNA-LNP）、不同构建体（foldon三聚体、纳米颗粒、膜锚定）中发挥作用，说明这种稳定化策略有通用性。而且mRNA-LNP疫苗兼具快速制备和高免疫原性的特点，结合稳定化HA后，很适合作为大流行防控的候选疫苗。其实这类稳定化突变也能尝试用于其他甲型流感的HA，说不定能成为流感疫苗研发的通用技巧。

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