纳米抗体+全人源库：基于临床支架和人类CDR的合成文库设计

2025年5月，Specifica团队在《MAbs》发表研究，报道了一种全新的VHH合成文库设计方法。他们以四个临床阶段的治疗性VHH为支架，引入经序列风险清除的人类VH3家族CDR1/2，并搭配来自人类B细胞的天然CDR3，构建了总转化子达2.3×10^10的文库。通过Protein A筛选确保正确折叠，并通过第二轮优化（去除多酪氨酸+热稳定性筛选）进一步提升可开发性。针对IFNα2等靶点的筛选直接获得了亲和力在97 pM至15.6 nM之间的VHH，且V2版本中74%的分子可开发性优秀。

研究流程：
选择临床VHH支架 → 人类VH3家族CDR1/2（清除风险）→ 酵母展示+Protein A过滤 → 人类B细胞CDR3 → 文库组装 → V2优化（多酪氨酸去除+热稳定性筛选）→ 针对IFNα2等靶点筛选 → 可开发性系统评估

一、为什么是突破？——“一步到位”的范式转变

传统VHH开发需免疫骆驼、人源化、亲和力成熟等多轮优化，耗时且可能损害特性。本研究将已临床验证的VHH作为支架，直接引入人类来源、经风险清除的CDR，并搭配天然人类CDR3，一步构建出高多样性、高“人性化”的文库，筛选出的VHH无需进一步优化即可具备药物样特性，实现了从“先发现后人源化”到“一步到位”的转变。

二、如何设计的，实验逻辑“四步法”

第一步：筛选优质支架。从9个临床VHH中选出4个（卡普赛珠单抗等），要求能结合Protein A、无额外半胱氨酸、具有典型VHH框架特征。

第二步：CDR1/2来源与过滤。从40个人类供体的NGS数据中提取VH3家族CDR1/2，清除序列风险（如脱酰胺、异构化、疏水斑等）。合成寡核苷酸池后，通过酵母展示和Protein A磁珠筛选，确保CDR不影响正确折叠。

第三步：CDR3来源与文库组装。从人类CD19⁺ IgM⁺ B细胞扩增CDR3，获得>10⁸多样性。将过滤后的CDR1/2与CDR3组装，构建噬菌体展示文库。

第四步：V2改进。针对CDR3，用RNase H降解含连续酪氨酸的mRNA（去除多酪氨酸）；针对CDR1/2，进行76℃热休克后Protein A筛选，富集耐热序列。

三、关键数据：数字背后的“硬核”实力

• 文库多样性：V1文库总转化子2.3×10¹⁰，CDR3独特序列1.6×10⁸。V2显著降低了多酪氨酸序列（连续3个酪氨酸比例从~15%降至~5%）。

• 亲和力范围：针对IFNα2筛选，V1和V2分别获得84和88个独特序列，亲和力在97 pM至15.6 nM之间，中位亲和力分别为2.8 nM和2.0 nM（图4c）。

• 可开发性提升：V2相比V1，在HPLC-SEC主峰纯度、SMAC保留时间、多反应性（PLE、心磷脂）等指标上显著改善。V2中74%的VHH具有≤2个可开发性风险（V1为60%）（图5l）。

• 普适性验证：针对另外10个靶点，90%的靶点获得至少一个<10 nM的VHH，50%获得亚纳摩尔级VHH（图4f）。

  
  

V2文库通过两项改进显著提升了可开发性：1）去除JH6基因编码的多酪氨酸序列（已知与多反应性相关），使CDR3的电荷分布更接近天然VHH；2）热休克筛选富集耐热CDR1/2，淘汰了热不稳定序列。数据显示V2在多个可开发性指标上优于V1，且亲和力相当，验证了“在设计阶段引入可开发性过滤”的策略有效性。

值得注意的是，四个支架中有一个（基于sonelokimab的Lib3）在V2中表现稍差，提示不同支架对CDR的耐受性存在差异。若将表现最佳的支架组合（V2的Lib1/2/4 + V1的Lib3），可使77%的VHH达到优秀可开发性标准，为后续文库优化提供了方向。

五、优势所在：从源头设计“药物样”VHH

与现有VHH开发方法相比，本研究构建的文库平台具有多维优势：

• 临床支架保证框架可靠性：选择已进入临床的VHH（卡普赛珠单抗等），确保框架具有良好的表达、稳定性和低免疫原性。

• 人类CDR1/2减少免疫原性：直接使用人类VH3家族CDR，避免了人源化步骤可能带来的亲和力损失。

• Protein A筛选保证正确折叠：利用Protein A结合依赖于正确构象的特性，一步过滤掉错误折叠或突变的序列，同时确保纯化便捷。

• 可开发性前移：在文库构建阶段就清除序列风险（多酪氨酸、热不稳定），使筛选出的VHH天然具备良好可开发性，无需后期改造。

• 系统评估VHH本身：首次对大量VHH单体进行多维度可开发性评估（而非依赖Fc融合），更贴近实际治疗应用。

本研究建立了一种高效的、可直接输出药物样VHH的文库平台，有望加速VHH药物的发现进程。其意义在于：

• 方法论价值：为合成抗体文库设计提供了新范式——将“可开发性”前置到文库构建阶段，结合临床支架和人类CDR，大幅降低后期优化成本。

• 应用前景：该文库可直接用于筛选针对各类靶点（包括膜蛋白、可溶性蛋白）的VHH，尤其适合需要快速获得高质量候选分子的场景。未来可进一步：1）纳入更多样化的临床支架；2）引入“骆驼化”突变以提升稳定性；3）结合AI预测CDR与支架的兼容性；4）拓展至双特异性或多特异性VHH构建。

Erasmus MF, et al. Developing drug-like single-domain antibodies (VHH) from in vitro libraries. MAbs. 2025;17(1):2516676. doi: 10.1080/19420862.2025.2516676.

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