中科院1区（8.3）-天麻素通过Keap1/Nrf2信号通路抑制肝铁死亡改善非酒精性脂肪肝病

【写在前面】：本期推荐的是由贵州医科大学附属医院感染病科、 贵州医科大学附属医院国家药物临床试验机构、贵州医科大学等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示天麻素通过Keap1/Nrf2信号通路抑制肝铁死亡改善非酒精性脂肪肝病。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Gastrodin ameliorates nonalcoholic fatty liver disease via inhibiting hepatic ferroptosis by the Keap1/Nrf2 signaling pathway

背景

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一个全球性的健康挑战，目前缺乏有效的治疗方法。天麻素（GAS）是从天麻（兰科）中提取的一种主要酚苷类化合物，具有多种有益特性，但其通过铁死亡途径在NAFLD中的潜在作用尚不清楚。

目的

研究GAS对NAFLD的治疗效果，并阐明其潜在的分子机制。

方法

我们使用高脂饮食（HFD）喂养的小鼠以及用棕榈酸（PA）和油酸（OA）处理的HepG2细胞建立了NAFLD模型。通过组织病理学和生化分析评估治疗效果。采用免疫共沉淀（Co-IP）、药物亲和响应靶标稳定性（DARTS）、细胞热位移分析（CETSA）和双荧光素酶报告基因检测等技术研究分子机制和药物靶点。

结果

GAS治疗显著减轻了肝脏炎症和脂质积聚，从而改善了代谢参数。此外，GAS减少了铁过载和氧化应激标志物，恢复了抗氧化防御能力，并保护了线粒体功能。机制研究表明，相互作用实验揭示GAS直接结合Keap1，破坏Keap1/Nrf2复合物，促进Nrf2核转位，并增强下游靶基因FSP1和GPX4的表达。

结论

GAS通过直接靶向Keap1/Nrf2信号通路抑制肝细胞铁死亡，显示出作为NAFLD治疗药物的显著潜力。

图文摘要

【前言】

非酒精性脂肪性肝病是一种普遍的慢性肝脏疾病，目前影响着全球约三分之一的人口。高脂高果糖饮食摄入和接触毒素等饮食习惯是脂肪肝发生的关键因素。该疾病以肝细胞内脂质过度积聚为特征，已成为慢性肝病的主要原因。随着病情进展，它可能发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。目前它被归类为一种多因素代谢性疾病，且尚无特异性治疗方法。人们普遍认为，其发病机制涉及肝细胞内脂质异常积聚、肝脏脂毒性、氧化应激、脂质过氧化和促炎因子。该疾病的特征是肝细胞内脂质积聚以及脂质代谢相关基因表达失调，从而导致脂质过氧化和氧化应激。氧化应激、脂质过氧化和线粒体功能障碍是细胞死亡的关键驱动因素。据报道，氧化应激会引发随后的肝脏损伤和肝细胞死亡，在该疾病的发病机制中起着关键作用。除了细胞凋亡和坏死，其他类型的细胞死亡也可能与其相关的肝毒性有关。

铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，其特征是铁驱动的多不饱和脂肪酸过氧化，导致活性氧积累和随后的细胞死亡。肝脏中的铁沉积与该疾病的各种组织病理学特征相关，相当比例的患者表现出肝脏铁过载，这会加重脂肪性肝炎。过度的铁积聚可能增加肝细胞气球样变、炎性浸润和纤维化进展，从而推动疾病向更严重的阶段发展。研究表明，铁死亡抑制剂可以减轻特定饮食诱导的脂肪性肝炎中的脂肪变性和炎症。与谷胱甘肽过氧化物酶4一起，铁死亡抑制蛋白1作为一种抗氧化调节剂，用于清除脂质过氧自由基并防止铁死亡。铁死亡抑制蛋白1是一种氧化还原酶，通过将辅酶Q10还原为泛醇来抑制铁死亡，泛醇是一种亲脂性自由基捕获抗氧化剂，可抑制脂质过氧化。核因子红细胞2相关因子2是细胞抗氧化反应通路的主要转录因子。在没有外源应激的情况下，Kelch样ECH关联蛋白-1与该因子相互作用，促进其泛素化和蛋白酶体降解。当该关联蛋白被修饰或与其他分子结合时，该因子与其分离，随后得以稳定、积累并发生核转位。该因子靶向铁死亡抑制蛋白1的启动子区域并影响其转录活性。研究表明，铁死亡抑制蛋白1可调节非小细胞肺癌细胞中的铁死亡。

天麻素是天麻根茎中的一种主要酚苷，具有抗凋亡、抗炎和抗氧化特性，并能调节脂质代谢。在药物或化学物诱导的肝损伤动物模型中，该成分抑制了炎症和氧化应激，并调节了肠道菌群组成。研究表明，该成分可以通过激活高脂高胆固醇饮食喂养小鼠体内的特定通路来改善脂肪肝。此外，该成分在接受高胆固醇饮食的模式生物中表现出抗氧化活性和降脂作用。然而，该成分对脂肪肝中肝细胞铁死亡以及疾病向更严重阶段进展的影响尚不清楚。该成分是一种潜在的铁死亡抑制剂。在药物诱导的肾毒性中，它通过介导特定信号轴抑制了肾小管上皮细胞的铁死亡。另一项研究中，它通过减少神经递质释放、细胞凋亡或氧化应激来保护胶质瘤细胞免受铁死亡的影响。目前尚无关于该成分是否能抑制肝细胞铁死亡并改善脂肪肝的报道。近期研究表明，该成分可激活特定通路并促进关键因子的表达。然而，该成分是否通过该关键因子影响铁死亡相关基因的表达尚未得到研究。

本研究证明，该成分通过抑制铁死亡来减轻肝损伤并减少肝脏脂质积聚。从机制上讲，它促进关键因子核转位并增加下游靶基因的转录，从而抑制肝细胞铁死亡并改善脂肪肝。这些发现表明，该成分是治疗该疾病的一个有前景的候选药物。

【结果部分】

1.天麻素改善了高脂饮食诱导的小鼠肝损伤和炎症。

图1. 天麻素（GAS）改善了高脂饮食（HFD）诱导的小鼠肝损伤和炎症。(A) GAS的化学结构式。(B) 实验时间线示意图。(C) 代表性肝脏外观照片及苏木精-伊红（H&E）染色图（比例尺：5 mm和40 μm）。(D) 肝脏重量及肝体比。(E) 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。(F) 肝脏切片中CD68免疫荧光染色图（比例尺：50 μm）。(G) 肝脏组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-18（IL-18）的mRNA表达水平。

2.天麻素在体内外实验中均减轻了肝脏脂肪变性。

图2. 天麻素（GAS）减轻了高脂饮食（HFD）诱导的小鼠肝脏脂肪变性。(A)肝脏切片代表性油红O染色图（比例尺：40 μm）。(B) 血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平。(C) 肝脏组织中TG和TC含量。(D) 肝脏组织中固醇调节元件结合蛋白1c（Srebp-1c）、肉碱棕榈酰转移酶1a（Cpt1a）、酰基辅酶A氧化酶1（Acox1）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（Ppara）及脂肪酸合酶（Fasn）的mRNA表达水平。(E) 蛋白质免疫印迹法检测SREBP-1C、CPT1A、ACOX1、PPAR-α及脂肪酸合酶（FAS）的蛋白表达水平。(F) 肝脏组织中PPARα免疫荧光染色图。(G) 葡萄糖耐量试验（GTT）结果。(H) 血浆葡萄糖水平。

3.天麻素在体内外均能抑制铁死亡。

图3. 天麻素（GAS）在体内外抑制铁死亡。(A)差异表达基因火山图（天麻素处理组，GAS vs. 高脂饮食处理组，M）。(B) 差异基因的KEGG富集分析。(C) 肝脏丙二醛（MDA）水平。(D) 肝脏谷胱甘肽（GSH）水平。(E) HepG2细胞中BODIPY 581/591 C11荧光（脂质过氧化）染色（比例尺：20 μm）。(F) HepG2细胞中JC-1染色（线粒体膜电位）（比例尺：20 μm）。(G) HepG2细胞中DHE（二氢乙啶，活性氧）染色（比例尺：20 μm）。(H) HepG2细胞中FerroOrange（亚铁离子）染色（比例尺：20 μm）。(I) HepG2细胞中线粒体的代表性电镜图像（比例尺：500 nm）。(J) HepG2细胞中转铁蛋白受体1（Tfr1）、谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）、铁死亡抑制蛋白1（Fsp1）、长链脂酰辅酶A合成酶4（Acsl4）和前列腺素内过氧化物合酶2（Ptgs2）的mRNA表达。(K) HepG2细胞中GPX4、FSP1、转铁蛋白受体1（TFR1）、ACSL4和膜铁转运蛋白1（FPN1）的蛋白水平。(L) 小鼠肝脏GPX4免疫荧光染色（比例尺：20 μm）。

4.天麻素在体外通过抑制铁死亡缓解非酒精性脂肪肝病。

图4. 天麻素（GAS）在体外通过抑制铁死亡缓解非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。(A)HepG2细胞中丙二醛（MDA）水平。(B) HepG2细胞中谷胱甘肽（GSH）水平。(C) DHE（二氢乙啶）染色（比例尺：20 μm）。(D) FerroOrange（亚铁离子）染色（比例尺：20 μm）。(E) BODIPY C11（脂质过氧化）荧光染色（比例尺：20 μm）。(F) JC-1（线粒体膜电位）染色（比例尺：20 μm）。(G) GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）免疫荧光染色（比例尺：40 μm）。(H) HepG2细胞中油红O染色（脂滴，比例尺：50 μm）。(I) SREBP1（固醇调节元件结合蛋白1）、CPT1A（肉碱棕榈酰转移酶1A）、ACOX1（酰基辅酶A氧化酶1）、PPAR-α（过氧化物酶体增殖物激活受体α）和FAS（脂肪酸合酶）的蛋白表达水平。(J) GPX4、FSP1（铁死亡抑制蛋白1）、TFR1（转铁蛋白受体1）、ACSL4（长链脂酰辅酶A合成酶4）和FPN1（膜铁转运蛋白1）的蛋白表达水平。

5.天麻素促进Nrf2核转位并增强FSP1和GPX4的转录表达。

图5. 天麻素（GAS）促进Nrf2核转位并增加FSP1和GPX4的转录。(A)小鼠肝脏中Nrf2（核因子E2相关因子2）和Keap1（Kelch样ECH关联蛋白1）的蛋白水平。(B) HepG2细胞中Nrf2和Keap1的蛋白水平。(C) 经PA+OA（棕榈酸+油酸）和/或GAS/SFN（萝卜硫素）处理的HepG2细胞中胞浆与细胞核Nrf2蛋白水平。(D) Nrf2免疫荧光染色（比例尺：5 μm）。(E) HepG2细胞中Fsp1和Gpx4的mRNA表达。(F) Nrf2峰顶富集的基序。(G) AIFM2（凋亡诱导因子线粒体关联蛋白2）启动子中ARE（抗氧化反应元件）结合位点示意图。(H) AIFM2启动子区域Nrf2结合峰的ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）结果（数据来源：GSE91809）。(I) Fsp1和Gpx4启动子活性的荧光素酶报告基因检测。

6.天麻素通过Keap1/Nrf2信号通路保护HepG2细胞免受铁死亡影响。

图6. 天麻素（GAS）通过Keap1/Nrf2信号通路保护HepG2细胞免受铁死亡影响。(A)丙二醛（MDA）水平。(B) 谷胱甘肽（GSH）水平。(C) DHE（二氢乙啶）染色（比例尺：20 μm）。(D) FerroOrange（亚铁离子）染色（比例尺：20 μm）。(E) JC-1（线粒体膜电位）染色（比例尺：20 μm）。(F) BODIPY C11（脂质过氧化）荧光染色（比例尺：10 μm）。(G) FSP1（铁死亡抑制蛋白1）免疫荧光染色（比例尺：40 μm）。(H) SREBP1（固醇调节元件结合蛋白1）、CPT1A（肉碱棕榈酰转移酶1A）、ACOX1（酰基辅酶A氧化酶1）、PPAR-α（过氧化物酶体增殖物激活受体α）和FAS（脂肪酸合酶）的蛋白表达水平。(I) 油红O染色（脂滴）（比例尺：50 μm）。(J) GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）、FSP1、TFR1（转铁蛋白受体1）、ACSL4（长链脂酰辅酶A合成酶4）和PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）的mRNA表达水平。(K) GPX4、FSP1、TFR1、ACSL4和FPN1（膜铁转运蛋白1）的蛋白表达水平。

7.天麻素直接靶向Keap1以降低其与Nrf2的结合。

图7. 天麻素（GAS）直接靶向Keap1以减弱其与Nrf2的结合。(A)通过细胞热位移分析检测GAS处理下Keap1的热稳定性。(B) 在48°C下，不同浓度GAS对Keap1稳定性的影响。(C) 在蛋白酶与蛋白比例为1:300的条件下，不同浓度GAS对Keap1稳定性的影响。(D) GAS与Keap1的分子相互作用示意图，结合能为-6.8 kcal/mol。(E) GAS处理后，通过免疫共沉淀检测Nrf2与Keap1的结合情况。

8.本研究的作用机制图。

【结论与讨论】

总之，我们的研究结果表明，天麻素（GAS）能够通过Keap1/Nrf2信号轴减轻高脂饮食（HFD）诱导的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）进展。 机制研究表明，GAS靶向Keap1，减少其与Nrf2的结合，并促进Nrf2的稳定与核转位。研究发现，GAS处理后，Nrf2与下游抗氧化基因的启动子结合，从而促进其转录并抑制铁死亡。本研究首次通过实验揭示，GAS通过靶向调节Keap1/Nrf2信号通路，改善了铁死亡驱动的NAFLD（图8）。 我们的发现为探索NAFLD的治疗确立了一种新的治疗策略和理论基础。

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