CAR-T设计的核心是蛋白工程

近日，吉利德宣布，拟以78亿美元（溢价约80%）的价格收购细胞疗法公司Arcellx。此前，吉利德旗下Kite Pharma与Arcellx合作，共同开发并销售一种用于多发性骨髓瘤（MM）的实验性CAR-T疗法（Anito-cel）。

Anito-cel已完成关键性2期注册临床研究（iMMagine-1），并获得FDA受理上市申请，PDUFA目标日期（审批决议截止日）为 2026年12月23日。

根据已披露的临床数据，Anito-cel展现出了优于明星产品Carvykti的潜力（表1），这也是促使吉利德高价收购Arcellx的重要原因。

表1. Anito-cel与Carvykti临床数据对比

如果比较Anito-cel与Carvykti的CAR设计可以发现两者最大的不同是胞外的抗原结合部分：Carvykti选择了两个VHH串联，而Anito-cel则用了一个D-Domain蛋白（图1）。

图1. 不同BCMA CAR-T结构比较

抗原结合部分的不同，很可能是导致两款CAR-T在临床上不同表现的根本原因。通过比较Anito-cel与Carvykti抗原结合部分的分子设计，凸显了蛋白工程在CAR-T设计中的核心地位。

1、Tonic Signaling

在CAR-T细胞疗法中，抗原非依赖性信号（Tonic Signaling）被称为T细胞的“慢性疲劳综合征”。它是指CAR-T细胞在没有接触到肿瘤抗原的情况下，自发产生的持续性激活信号。这种现象是导致CAR-T疗法失效（尤其是持久性差）的核心原因之一。

Tonic Signaling的根源在于CAR分子胞外结合域（通常是scFv）的结构不稳定，易自发聚集（Self-aggregation）。传统的scFv由重链（VH）和轻链（VL）通过一段Linker连接（图2A）。由于其疏水表面暴露或折叠不稳定，scFv分子之间倾向于像磁铁一样互相吸引并聚集在一起。

图2. (A) scFv；(B) VHH；(C) D-Domain结构示意图

当胞外的结合域发生聚集，胞内的信号域（如CD3和4-1BB/CD28）也会随之靠拢并发生磷酸化。这欺骗了T细胞，让它以为自己正在攻击肿瘤。

这种持续的低水平背景信号对T细胞具有毁灭性影响：（1）引起早期耗竭（Exhaustion）： T细胞长期处于“待机即工作”的状态，导致表型从记忆性向终末分化型转变，高表达PD-1、LAG-3等抑制性受体；（2）扩增能力受限：当真正的肿瘤抗原出现时，这些已经“疲惫不堪”的T细胞无法进行强有力的克隆扩增；（3）分化失衡：细胞过早失去干性（Stemness），导致其在体内的存续时间（Persistence）大幅缩短。

在BCMA CAR-T的三剑客中，BMS的Abecma被公认为拥有最高水平的Tonic Signaling，这也是其在临床数据（尤其是PFS）上显著落后于Carvykti和Anito-cel的结构性根源。而Abecma使用的正是最传统的scFv（源自鼠源抗体序列）。

Carvykti在CAR设计上串联了两个VHH（VHH1和VHH2）。虽然这极大提升了亲和力，但在细胞膜表面的高密度表达下，VHH的β片层结构（图2B）以及这种长链串联结构比单价结构有更高的概率发生物理碰撞或微簇化（Micro-clustering），使T细胞提前进入耗竭状态。

研究显示，虽然Carvykti的Tonic Signaling极低，不足以让T细胞迅速进入耗竭状态（这也是其PFS极长的原因），但在基底状态下仍存在微弱的磷酸化信号。

Anito-cel的D-Domain是单链三α-螺旋（α3D）结构（图2C），由美国宾夕法尼亚大学的 William F. DeGrado教授团队于1999年计算并设计。α3D没有scFv那种复杂的VH/VL界面和容易诱发聚集的Linker。在In Silico（计算机模拟）优化过程中，Arcellx调整了D-Domain表面的电荷分布，使分子间产生静电排斥而非吸引。临床前对比显示，表达D-Domain的CAR-T细胞在静息状态下的磷酸化水平极低，保持了极高的“初始/记忆”表型比例。

Tonic Signaling不仅影响疗效，还与毒性相关。持续的信号可能导致基底水平的细胞因子（如IFN-γ）释放，增加患者发生非特异性炎症风险。细胞在非肿瘤部位（如脑部）的慢性低水平激活，被认为是Carvykti产生延迟神经毒性（DNT）的诱因之一。

2、Koff

传统的CAR-T往往追求极高的亲和力，尤其是Carvykti的双VHH（双Epitope）设计以及产生的Avidity效果（Koff在10-4S-1数量级），一旦抓住肿瘤细胞就像“强力胶”一样死死粘住，导致CAR-T的解离极其困难。

牢固的结合确保了T细胞能持续接收激活信号，从而诱导极深的临床缓解（sCR达80%以上）。 但由于解离极慢，T细胞容易在表达极低水平 BCMA的非肿瘤组织（如大脑基底节）中发生非特异性累积，这被认为是造成Carvykti约10%延迟性神经毒性的核心机制。

而Anito-cel的D-Domain被设计为“快进快出”（Koff在10-2S-1数量级），它能迅速识别并结合BCMA触发杀伤信号，但在完成任务后会快速解离。

因此，单个CAR-T细胞可以像“连环杀手”一样，在极短时间内连续攻击多个肿瘤细胞，而不是被困在第一个目标的残骸上。这就是为什么它即使在剂量较低时，也能达到90%以上的总缓解率 (ORR)。

传统CAR-T的长时间的强力结合会导致T细胞持续释放超生理水平的细胞因子（如IL-6），形成失控的正反馈。Anito-cel的快解离特性限制了单次结合诱发的细胞因子释放强度。这种“点到为止”的激活方式足以杀死肿瘤，但不足以引发严重的CRS（表2）。

表2. Anito-cel与Carvykti的机制对比

此外，血液中存在大量的游离BCMA，快解离的D-Domain不会被这些“游离靶点”永久锁定，从而保持了在骨髓病灶中的渗透能力。

MM髓外疾病患者（EMD）通常预后极差，对常规CAR-T响应较低。在Anito-cel iMMagine-1的EMD亚组中，24个月PFS率仍达57.5%。而Carvykti在EMD患者中的PFS仅8.1个月（CARTITUDE-1）。

3、免疫原性

在CAR-T疗法中，免疫原性（Immunogenicity）是决定药物“长效”的隐形防线。如果说疗效决定了CAR-T能跑多快，那么免疫原性就决定了它能跑多远。

如果CAR分子（如鼠源scFv）被识别为异物，患者体内会产生抗药物抗体 (ADA) 。这些抗体像“导弹拦截系统”一样，在CAR-T细胞还没开始大规模杀伤肿瘤前就将其从循环中清除。

除了体液免疫（抗体），宿主的T细胞（CTL）也会攻击表达异源蛋白的 CAR-T细胞。这种内耗会导致CAR-T细胞无法达到预期的峰值浓度 (Cmax)，直接削弱了对高肿瘤负荷患者的杀伤力。

Carvykti的VHH虽然经过高度人源化，但其复杂的双VHH结构和Linker仍可能被免疫系统识别。在CARTITUDE-1研究中，约19%的患者出现了ADA。

D-Domain基于α3D合成蛋白，根据Arcellx披露的专利数据，α3D本身在计算生物学评分中具有极低的固有免疫原性分数。

Arcellx通过扫描整个D-Domain氨基酸序列，寻找可能与人类主要的HLA II类分子（MHC-II）高亲和力结合的片段（即T细胞表位）。这种预测覆盖了全球95%以上人口的各种等位基因，确保其在不同族裔中都具有极低的排异风险。

Arcellx然后在D-Domain噬菌体展示库的构建阶段，直接在DNA水平上通过定向诱变（Targeted Mutagenesis）替换掉那些高风险的氨基酸（De-immunization）。 同时使用计算模型验证这些替换是否会破坏三螺旋结构的稳定性或降低对BCMA的亲和力。如果一个变体的免疫原性分数过高，它将在进入临床前被直接剔除。

最后通过第三方验证（如Abzena的EpiScreen平台），通过将去免疫原化后的D-Domain与来自不同健康捐赠者的T细胞共同培养，观察其实际引发的T细胞增殖反应。数据证明，D-Domain的免疫原性甚至可以低至重组人源化抗体（如Herceptin）水平。

Anito-cel的设计确保了其序列片段与人类MHC-II分子的亲和力极低，从而切断了被免疫系统“标记”的路径。临床数据显示，Anito-cel在回输12-24个月后仍表现出极强的细胞活性。

根据iMMagine-1研究数据，Anito-cel扩增曲线表现出更好的稳健性。由于“快解离”和“低免疫原性”的双重作用，其细胞在体内的表型更偏向于记忆性T细胞 (Memory T cells)，这类细胞不仅扩增能力强，且在体内存活时间更久。

而Carvykti则表现为“爆发式”扩增，峰值极高，但由于其高亲和力导致的持续刺激，部分细胞会较快进入耗竭阶段。

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