上海交大AM：新型多阶段相变肽凝聚体，为智能生物材料开辟新途径

在自然界中，生物分子凝聚体通过刺激触发的多阶段相变来响应外部应激。然而，现有的合成凝聚体通常依赖于溶剂或离子强度的变化来驱动多阶段转变，这种依赖性阻碍了在生理条件下实现连续、可逆的相变，从而限制了其在实际应用中的相编程能力。这一局限性主要源于合成系统缺乏动态模块结构域，无法在全局相调控过程中协调其组装途径。

近日，上海交通大学冯传良教授、宋阳副教授合作，报道了一类由低复杂度结构域衍生出的短肽合成子（分子量约1500道尔顿）。这些肽合成子在单体、自凝聚体、液晶和半结晶固体凝胶之间表现出热可逆的四重相变。机理研究揭示，这些相变由凝聚和纤颤化两种不同的组装途径共同调控，它们以协同和竞争的方式相互作用。通过修饰肽序列或分子结构，可以精确控制相变温度，使多阶段相变能够在体温（37°C）下由剂量依赖的病理信号（如乳酸）激活。相关论文以“Multistage Phase Programming in Fibrillated Peptide Coacervates”为题，发表在

Nature Communications

研究人员从天然低复杂度结构域中选择了代表性的LARKS基序（-GGYGGG-），将其作为动态“粘合剂”整合到四苯乙烯标记的相分离肽中，合成了名为“LPD”的短肽衍生物。当将LPD（5 mg/ml）溶解在热盐水溶液中并以0.1°C/min的速率缓慢冷却时，研究团队观察到一系列显著的多阶段相变：在55°C时，透明溶液中首先成核出亚稳的凝聚体液滴；随着温度降至53°C，这些液滴转变为具有双折射特性的液晶相；当温度降至39°C以下时，最终固化为微米级凝胶。凝聚体和液晶相都表现出时间依赖的融合和光漂白后荧光恢复，证实了其液体特性，而凝胶相则不具备这些特性。扫描电镜观察显示，凝聚体呈现无定形形态，而液晶相和凝胶相则呈现出纤维状纳米结构，且多数纳米纤维具有优先取向，这与Onsager理论和液-液晶相分离模型相符。

图1： LARKS编码的肽衍生物在缓慢冷却过程中表现出多阶段相变。(a) 分子结构示意图。明场和偏光显微镜揭示了从单体→凝聚体(b)→液晶(d)→固体凝胶(f)的多阶段转变。液滴融合用虚线圆圈标出。凝聚体(c)、液晶(e)和固体凝胶(g)的SEM图像。(h和i)凝聚体、液晶和固体凝胶的FRAP测试（用罗丹明红染色）。(j)液晶和固体凝胶的流变学性质，其中G'（储能模量）和G"（损耗模量）作为角频率的函数绘制。LPD浓度，5 mg/ml。

为了理解纤颤化在相变中的作用，研究人员使用淀粉样蛋白特异性染料ThT对体系进行染色。随着温度从60°C降至30°C，分散相中的ThT荧光显著增强，表明β-折叠纤维的形成增加。纤颤化动力学研究表明，在30-40°C的低温条件下纤颤化进程更快。在整个热循环过程中，分散相的双折射强度与热可逆纤颤化同步变化。通过系统改变LPD浓度，研究团队绘制了相图，显示LLPS的临界浓度约为0.07 mg/ml，且随着浓度增加，凝聚体相的温度窗口逐渐缩小，而液晶相的温度窗口扩大，表明在高浓度下纤颤化在驱动相变中发挥更重要的作用。

图2： 热响应性纤颤化推动凝聚体中的无序-有序转变。(a) 无序-有序转变示意图。(b) 荧光显微镜图像揭示液滴内纤颤化（ThT，绿色）逐步增强，促进偏光下的液晶形成。虚线圆圈表示明场下的液滴位置。(c) 给定温度下的纤颤化动力学研究。(d) LPDs的热可逆纤颤化，如标准ThT荧光测定所示，与液晶的可逆形成相关(e)。(f) 显示多阶段转变的相图。冷却速率，0.1°C/min。(g) 水混合物中纤颤化水平作为温度和LPD浓度的函数量化。拟合曲线代表LLPS、液-液晶相分离和液-固相分离的计算边界。重复次数：n = 6。

进一步研究表明，多阶段相变受到“无序凝聚”和“有序纤颤化”两种途径的协同与竞争调控。在缓慢冷却速率下（0.1-1°C/min），凝聚体首先成核，作为液体储库浓缩单体并启动纤颤化，促进从凝聚体到液晶相的转变。而在快速冷却速率下（10-10²°C/min），凝聚体的生长受到动力学抑制，产生亚微米级的小凝聚体，纤颤化过程在低温下主导自组装，形成“串珠状”结构，导致双折射强度显著降低。

图3： 凝聚和纤颤化的竞争性组装途径支配着多阶段相变。(a–d)不同冷却速率下LPDs的SLCM图像和(e–h)纤丝（ThT，绿色）的分布。(i–l) SEM图像显示肽组装体的形貌。随着冷却速率增加，液滴中的纤颤化水平相对于连续相中的纤颤化水平下降(m和n)。(o)不同冷却速率下双折射强度的变化，插图显示样品的偏光显微镜图像。重复次数：n = 6。

通过对LPD序列进行系统修饰，研究团队实现了对多阶段相变温度的精确调控。将阳离子精氨酸替换为赖氨酸或组氨酸，LLPS的临界温度随阳离子-π/π-π相互作用的强度变化而改变，液晶和凝胶的形成温度也同步变化。将阴离子天冬氨酸替换为谷氨酸或谷氨酰胺，对相变温度影响较小。在LARKS基序中替换芳香族氨基酸，将酪氨酸替换为疏水性更强的苯丙氨酸会显著提高各相变温度，而替换为亲水性更强的丝氨酸则降低相变温度，但丝氨酸的小侧链允许更紧密的堆积，在凝胶相中表现出更高的纤颤化程度。

图4： 基于序列的调控控制多阶段相变的临界温度。(a–c) LPD中阳离子氨基酸的取代。(a) 光密度测量作为冷却函数。显示了不同取代的明场和偏光显微镜图像(b和c)。(d–f) 离子氨基酸的替换对相变影响最小。(g–i) LARKS中芳香族氨基酸的替换。LPD浓度固定为5 mg/ml。冷却速率，1°C/min。比例尺，10 µm。

最后，研究团队探索了这些LPDs在疾病信号检测和药物释放方面的应用潜力。乳酸是一种疾病标志物，在病变组织中过表达。研究发现，TPE-RGGYGGGSDG和TPE-HGGYGGGSDG两种肽对乳酸表现出不同的敏感性：前者在30、100和300 mM乳酸浓度下发生凝胶→液晶→凝聚体→单体的逐步相变，而后者在2 mM和5 mM的低浓度乳酸下即可实现液晶→凝聚体→单体转变，敏感性提高约50倍。在载药释放实验中，预先装载阿霉素的TPE-RGGYGGGSDG凝胶在不同乳酸浓度下表现出依赖相态的药物释放动力学。

图5： LPDs被编程为对疾病信号检测和响应性药物释放具有可调敏感性。(a) 信号触发的多阶段相变示意图。(b) TPE-RGGYGGSDG和(c) TPE-HGGYGGSDG在多阶段相变过程中对乳酸表现出不同的敏感性。比例尺，25 µm。(d和e)通过改变乳酸浓度分别检测两种LPD组装体中的纤颤化水平。(f) TPE-RGGYGGSDG组装体响应乳酸释放抗肿瘤药物阿霉素。LAC浓度分别为0、30、100、300 mM。所有实验均在37°C、150 mM NaCl溶液中进行。重复次数：n = 4。

总结与展望：本研究展示了一类具有多阶段相变的LARKS编码肽衍生物，其特征是从溶解单体到自凝聚体、再到液晶、最终到固体凝胶的逐步演变。定量分析揭示了这些转变由纤颤化和凝聚两种组装途径以协同和竞争的方式共同驱动。通过改变LPD序列和化学修饰，可以精确调控多阶段相变，实现在37°C下对热信号和生化信号（如乳酸）的程序化、多步骤响应。尽管LPDs为智能相编程提供了一个有前景的平台，但要推进其实际应用，仍需解决几个挑战。未来的研究应集中于阐明其对生化信号响应的特异性，减少非特异性吸附分子的干扰，并最终在复杂组织环境和疾病模型中验证其作为智能生物材料的功能。