用中药入血成分鉴定发了篇2区：清郁养精方调节下丘脑-垂体-性腺轴、抑制氧化应激与凋亡，改善少弱精子症~

【写在前面】：本期推荐的是由江苏省中医院、南京中医药大学第一临床医学院等研究团队合作近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示清郁养精方通过调节下丘脑-垂体-性腺轴,抑制大鼠睾丸氧化应激和细胞凋亡,从而改善环磷酰胺诱导的少弱精子症。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Qingyu Yangjing formula ameliorates cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia by regulating the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and inhibiting testicular oxidative stress and apoptosis in rats

民族药理学相关性

清郁养精方（QYYJF）是一种传统中药（TCM），是治疗少弱精子症（OAS）的经典方剂，在补肾填精方面具有显著的临床疗效。然而，其化学成分尚不明确，且QYYJF治疗OAS的作用机制仍不清楚。

研究目的

表征QYYJF吸收入血的原型化学成分，并阐明其对大鼠OAS的治疗作用。

方法

为鉴定吸收入血的原型化合物，在给大鼠连续5天灌胃QYYJF（11.55 g/kg）后采集血清样本，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）进行分析。将40只雄性大鼠腹腔注射环磷酰胺（CP）（40 mg/kg），连续5天，建立OAS模型，随后分别给予低、中、高剂量（5.77、11.55和17.32 g/kg/d）的QYYJF治疗14天。使用Makler计数板评估精子质量。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴激素、睾丸氧化应激标志物和炎症细胞因子。采用苏木精-伊红（HE）染色观察组织病理学变化，并使用蛋白质印迹法（WB）分析凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9）的表达水平。

结果

在血清中共检测到515个原型成分，其中25个经结构鉴定，主要为黄酮类、三萜皂苷类、苯丙素类和内酯类化合物。CP诱导的OAS大鼠睾丸重量、睾丸指数、精子密度和活力显著降低，HPG轴激素紊乱，氧化应激水平升高，炎症细胞因子增加。HE结果显示睾丸组织出现严重结构损伤，同时凋亡相关蛋白表达增加。QYYJF治疗可改善这些变化，提高精子质量，恢复激素平衡，减轻氧化应激和炎症，并抑制睾丸细胞凋亡。

结论

CP通过破坏HPG轴平衡、诱导氧化应激和细胞凋亡来损伤精子发生。QYYJF通过恢复HPG轴功能、减轻氧化应激和炎症、抑制睾丸细胞凋亡，发挥对OAS的治疗作用。

图文摘要

【前言】

男性不育症因不健康的生活方式和日益增加的生活压力而成为一个全球性问题。少弱精子症的特征是精子数量显著减少和活力受损，是男性不育的主要原因。全球范围内，15%的育龄夫妇存在不育问题，其中50%与男性不育有关。西医治疗该病主要采用左卡尼汀、维生素E和抗雌激素药物，但由于疗效不一和不良反应，其临床应用常受限制。

多种化疗药物，包括环磷酰胺，被广泛用于癌症治疗。然而，环磷酰胺是不育症的主要原因。它通过氧化应激、炎症、细胞凋亡和性激素失衡等机制，诱导睾丸组织损伤，破坏精子发生，并导致少弱精子症。这凸显了针对环磷酰胺诱导的生殖毒性寻求有效治疗策略的迫切性。

传统中医药凭借其在治疗生殖疾病方面数千年的临床实践经验，为男性不育症提供了一种有前景的疗法。在中医理论中，男性不育根据特定的病因病机和辨证论治，使用中药复方进行分类和治疗。包含菟丝子、枸杞子及其他补肾中药的中药复方，传统上用于补肾填精，这是中医体系中治疗男性不育的关键原则。既往研究阐明了中药对精子质量的潜在益处。然而，这些中药复方针对环磷酰胺诱导的生精功能损伤的具体保护作用、其入血成分的鉴定以及潜在的蛋白质通路仍有待深入探索。

精子发生受下丘脑-垂体-性腺轴调控。中药通过影响促性腺激素释放激素、雌二醇、黄体生成素、卵泡刺激素和睾酮的释放来调节HPG轴激素。此外，中药还能增强支持细胞和间质细胞的功能，减轻睾丸炎症，对抗氧化应激，并减少细胞凋亡。同时，它们可能改善睾丸微环境，降低睾丸组织中的氧化应激，促进精子发生，提高精子质量。阐明中药 Efficacy 的作用机制对于理解其整体治疗效应和作用机理至关重要。

超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱是一种强大的分析技术，能够实现复杂组分的快速分离和高灵敏度鉴定。该技术对于鉴定给药后吸收入血的中药复方生物活性成分至关重要。

清郁养精方，原名聚精汤，首载于《徐福松男科纲目》，源于徐福松教授的临床经验方，适用于肾虚型少弱精子症所致的不育症。因后期中药新药转化及江苏省药品监督管理局审批的要求，“聚精汤”更名为清郁养精方。作为循证中药复方，该方经过江苏省中医院多年的临床经验优化。近年来，其在少弱精子症患者中显示出显著的治疗效果，体现了中医治疗少弱精子症的 holistic 理念。该方基于“肾主生殖”理论，融合“补肾”与“填精”之法，针对少弱精子症的核心病机——肾精亏虚进行治疗。该方由菟丝子、枸杞子等补肾填精的经典中药组成，旨在填精益气，并促进气血沿HPG轴运行。自2010年代初以来的初步临床观察表明，清郁养精方及其随证加减，能提高肾虚型少弱精子症患者的精子质量参数和妊娠结局。然而，其潜在机制尚未完全阐明。

尽管清郁养精方的临床经验应用已有初步记载，但尚缺乏针对环磷酰胺诱导的少弱精子症 Efficacy 的全面科学验证，同时对其入血成分的鉴定以及在分子和组织学水平上的机制理解也存在不足。本研究旨在采用多维度方法：建立环磷酰胺诱导的少弱精子症大鼠模型，通过评估精子质量和采用ELISA法检测血清中HPG轴激素水平，以评价清郁养精方的治疗效果。采用ELISA法检测睾丸组织中关键氧化应激和炎症细胞因子的水平。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定清郁养精方给药后吸收入血的原型成分，从而阐明其体内药效成分。采用苏木精-伊红染色评估睾丸组织病理学，并通过蛋白质印迹法分析睾丸组织中关键的凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Caspase-3和Caspase-9，以阐明潜在的蛋白通路机制。通过将入血成分鉴定与功能评估、组织病理学和蛋白通路分析相结合，本研究为清郁养精方对抗环磷酰胺诱导的睾丸组织损伤提供了全面的理解。研究结果为清郁养精方的临床应用奠定了药理学基础，并有助于更好地理解中医药治疗少弱精子症的机制。

【结果部分】

1. 清郁养精方中鉴定的成分类型。

图 1 清郁养精方（QYYJF）血中原型成分示意图（a）正离子模式；（b）负离子模式

2.清郁养精方的化学结构及裂解规律。

图2. 可能的裂解途径。（a）金丝桃苷；（b）隐丹参酮；（c）原儿茶醛。

图 3. 可能的裂解途径。（d）异毛蕊花糖苷；（e）毛蕊花糖苷。

3.清郁养精方显著改善少弱精子症大鼠的生精功能。

图 4. 睾丸组织 HE 染色（200×，比例尺 = 200 μm）。组织病理学分析显示，模型组精子发生严重紊乱，生精小管受损，生精细胞层减少。在 QYYJF 和左卡尼汀组中，这些病理改变得到显著改善（见白色方框内）。

图 5. QYYJF 改善少弱精子症大鼠睾丸组织重量和精子质量（a）双侧睾丸重量；（b）睾丸指数；（c）精子密度；（d）精子活力。结果以均值 ± 标准差表示（n = 8）。

图 6. QYYJF 改善少弱精子症大鼠 HPG 轴血清激素水平（a）血清睾酮水平；（b）血清黄体生成素水平；（c）血清卵泡刺激素水平；（d）血清促性腺激素释放激素水平；（e）血清雌二醇水平。

图 7. QYYJF 改善少弱精子症大鼠睾丸组织氧化应激水平和炎症细胞因子（a）睾丸组织 SOD 活性；（b）睾丸组织 MDA 含量；（c）睾丸组织 GSH-PX 活性；（d）睾丸组织 ROS 荧光强度；（e）睾丸组织 TNF-α 水平；（f）睾丸组织 IL-6 水平；（g）睾丸组织 IL-1β 水平。

图 8. 睾丸组织中凋亡相关蛋白表达水平及定量结果（a）Bax；（b）Bcl2；（c）裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；（d）裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；（e）蛋白表达定量结果。

【结论与讨论】

环磷酰胺破坏了大鼠睾丸组织的结构和功能，导致少弱精子症的发生。清郁养精方作为一种中药复方，通过调节下丘脑-垂体-性腺轴相关激素，减轻睾丸组织的氧化损伤和炎症，并抑制生精细胞凋亡，从而发挥补肾填精之效，成为治疗少弱精子症的有效方法。

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