苏州纳米所/苏大ACS Nano：仿生多层导电神经导管为周围神经长段缺损修复提供新策略

周围神经损伤是临床常见问题，常导致严重残疾并造成巨大的社会经济负担。由于神经轴突再生缓慢、易发生方向性误导和突触错配，神经的自我再生能力难以实现功能恢复。临床上，长段神经缺损（超过5毫米）的治疗尤为棘手。尽管自体神经移植被视为“金标准”，但其面临着供区并发症和尺寸匹配困难等问题。为应对这些挑战，组织工程领域发展了多种神经引导导管，但现有的人工神经导管普遍存在成分单一、结构简单以及缺乏仿生结构等局限性。天然神经的多层结构——包括神经外膜、神经束膜和神经内膜——突显了复合结构对于再现神经结构复杂性的重要性。

近日，中国科学院苏州纳米所程国胜研究员、郝莹副研究员与苏州大学赵荟菁教授、肖淼副研究员合作，受天然神经多层结构的启发，开发了一种结合水凝胶和针织丝纤维套管的仿生多层导电神经引导导管，用于周围神经再生。该复合导管整合了外层丝素蛋白针织套管以提供机械支撑并模拟神经外膜结构、内层由丝素蛋白和甲基丙烯酰化明胶组成的多通道水凝胶以促进细胞黏附和神经营养因子释放，并引入聚吡咯实现电活性调控。研究表明，SF/GelMA/Ppy/KS复合导管具有可降解性、导电性、机械稳定性、定向结构，并表现出良好的体外和体内生物相容性。在大鼠坐骨神经长段缺损模型中移植该复合导管，成功实现了神经再生和功能恢复。通过将仿生结构与多功能生物材料相结合，该研究为长段神经再生提供了一种有前景的人工神经导管。相关论文以“Bioinspired Multilayered Conductive Nerve Guidance Conduit Built on Hydrogels and Knitted Silk Fiber Sleeves for Peripheral Nerve Regeneration”为题，发表在

ACS Nano

图1： 具有人工仿生神经外膜结构的双网络导电水凝胶神经导管的复合支架示意图，将其移植到坐骨神经横断部位用于神经修复和再生。

研究团队首先详细展示了SF/GelMA/Ppy/KS复合导管的制备过程和多尺度结构特征（图2）。宏观照片显示，长度为10毫米的复合导管结构完整；扫描电镜观察揭示了内部的多微通道水凝胶结构，这种设计有助于引导轴突再生并促进周围神经损伤修复。外层丝素蛋白针织套管在浸涂前纤维较为松散、孔隙不规则，经过丝素蛋白/聚环氧乙烷/甘油浸涂后，丝纤维表现出良好的结构稳定性和规整性，形成了类似于天然坐骨神经外膜胶原纤维网络的分级互联纤维结构。力学测试表明，浸涂后的针织套管保持了88.4 ± 0.7 MPa的高断裂强度，断裂伸长率约为45%，与天然神经外膜的生理断裂伸长率相当。值得注意的是，PPy的引入增强了水凝胶的力学和电学性能，SF/GelMA/Ppy水凝胶的压缩模量较纯SF或GelMA水凝胶显著提高，电导率达到1.1×10⁻² ± 1.3×10⁻³ S/cm，处于天然神经组织的生理电导率范围内。LED灯泡点亮实验进一步证实了其导电性。此外，SF/GelMA/Ppy水凝胶表现出232.5 ± 47.1%的溶胀率和适宜的降解特性，与KS复合后溶胀率降低至126.9 ± 16.4%，表明外层KS结构限制了内部水凝胶的溶胀。

图2： 复合神经导管的制备、表征、扫描电子显微镜观察及性能。（a）SF/GelMA/Ppy/KS导管制备示意图。（b）SF/GelMA/Ppy/KS导管的照片。（c）SF/GelMA/Ppy水凝胶的横截面。（d）SF/GelMA/Ppy水凝胶的纵截面。（e）未浸涂针织套管的扫描电镜图。（f）浸涂后针织套管的扫描电镜图。（g）未浸涂针织套管和浸涂针织套管的拉伸性能。（h）未浸涂针织套管和浸涂针织套管的弹性模量。（i）不同水凝胶的压缩性能（SF、GelMA、SF/GelMA、SF/GelMA/Ppy水凝胶）。（j）不同水凝胶的压缩模量。（k）SF/GelMA/Ppy水凝胶的导电性（LED灯）。（l）不同材料的导电性（SF、GelMA、SF/GelMA、SF/GelMA/Ppy、SF/GelMA/Ppy/KS）。（m）不同水凝胶的溶胀性能。（n）不同水凝胶的降解速率。数据为平均值±标准差；Tukey事后检验后采用单因素方差统计分析（每组n=3），ns表示无显著差异，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001表示显著性差异。

在体外生物相容性评估中（图3），研究团队将施万细胞接种于不同支架材料上培养。三维共聚焦图像显示，施万细胞在整个神经导管内铺展和生长，活/死染色证实四种支架上的细胞存活率均超过95%，这主要归功于SF、GelMA和PPy优异的生物相容性。免疫荧光染色结果显示，SF/GelMA/Ppy组细胞S100蛋白表达水平显著高于其他组，这可能归因于PPy的导电性模拟了神经电生理微环境，激活了与施万细胞增殖和分化相关的信号通路，促进细胞向成熟施万细胞分化。四组细胞中GFAP均呈低水平表达，且组间无显著差异。体内生物相容性实验将SF/GelMA/Ppy/KS支架植入SD大鼠下肢肌肉，12周后HE和Masson染色未见明显炎症反应，肌肉组织长入支架内部，表明该复合支架具有良好的组织相容性。

图3： 不同支架上施万细胞的体外培养。（a）施万细胞接种于神经导管支架的示意图，包括生长、迁移和延伸突起。（b）培养第3天，FITC和DAPI标记的施万细胞在SF/GelMA/Ppy支架上生长和分布的三维共聚焦图像。比例尺：500 μm。（c）活细胞（钙黄绿素-AM，绿色）和死细胞（碘化丙啶，红色）的代表性图像。比例尺：100 μm。（d）来自（c）的细胞活力统计。（e，f）S100和GFAP的代表性免疫荧光图像。比例尺：200 μm。（g，h）来自（e）和（f）的免疫荧光结果统计。数据为平均值±标准差；Tukey事后检验后采用单因素方差统计分析（每组n=3），ns表示无显著差异，*p < 0.05，**p < 0.01表示显著性差异。

为评估再生神经的功能恢复情况（图4），研究团队测定了复合肌肉动作电位。结果显示，SF/GelMA/Ppy移植组较横断组显著改善了神经冲动传导功能，其CMAP振幅（约5 mV）略低于正常对照组（约3 mV），表明SF/GelMA/Ppy能够在移植后发挥神经冲动传导作用。通过步态分析评估坐骨神经功能指数，SF/GelMA/Ppy/KS组和自体移植组的SFI评分高于SF/GelMA/Ppy组，且SF/GelMA/Ppy/KS组与自体移植组间无显著统计学差异。腓肠肌形态分析显示，所有手术侧均出现一定程度的肌肉萎缩，但SF/GelMA/Ppy/KS组和自体移植组的肌肉萎缩程度较轻，腓肠肌湿重恢复率相近，胶原纤维增生较少。这些结果表明，SF/GelMA/Ppy/KS神经导管支架的植入促进了坐骨神经损伤后的功能恢复，KS因其与神经外膜的结构相似性，在支持、保护、营养供应和免疫屏障方面发挥了重要作用。

图4： 大鼠坐骨神经和腓肠肌的体内形态和功能评估。（a）复合肌肉动作电位信号采集示意图。（b）该图描述了当在生物神经末端引入外部电压偏移时，通过不同类型神经传递的电压如何随时间演变。（c）CMAP的峰值振幅。（d）12周后模型大鼠的步态分析。比例尺：5 mm。（e）来自（d）的大鼠模型坐骨神经功能指数。（f）12周后分离的模型大鼠腓肠肌。比例尺：1 cm。（g）来自（f）的模型大鼠腓肠肌湿重比统计。（h）手术侧腓肠肌横截面的Masson三色染色代表性图像。比例尺：100 μm。（i）来自（h）的胶原纤维面积定量分析。数据为平均值±标准差；Tukey事后检验后采用单因素方差统计分析（每组n=3），ns表示无显著差异，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001表示显著性差异。

研究团队进一步对再生神经的组织形态学进行了多模式技术评估（图5）。术后12周，SF/GelMA/Ppy/KS组再生神经较SF/GelMA/Ppy组更粗。HE染色显示，SF/GelMA/Ppy/KS组再生神经纤维生长密度更高、再生组织面积更大，表明KS能增强施万细胞增殖和神经再生能力。甲苯胺蓝染色显示，SF/GelMA/Ppy/KS组施万细胞数量远高于SF/GelMA/Ppy组，接近自体移植组。透射电镜观察显示，SF/GelMA/Ppy/KS组有髓轴突直径（3.2 ± 0.4 μm）和髓鞘厚度（650.7 ± 95.19 nm）均显著高于SF/GelMA/Ppy组，与自体移植组相近。G-比值（轴突直径与神经纤维总直径之比）在SF/GelMA/Ppy/KS组（0.72 ± 0.05）和自体移植组（0.73 ± 0.05）相近，表明SF/GelMA/Ppy/KS组在神经信号传导功能、形态重建和神经再生方面优于SF/GelMA/Ppy组。

图5： 通过多模式技术揭示修复后坐骨神经的组织形态学。（a）动物实验操作流程示意图。（b）植入后12周再生坐骨神经的照片。比例尺：5 mm。（c）12周后再生神经组织横切面的HE染色图像。右侧比例尺：50 μm。（d）再生神经纵切面的TB染色图像。左侧比例尺：500 μm，右侧比例尺：100 μm。（e）移植后12周再生神经纤维的代表性TEM图像。左侧比例尺：100 μm，右侧比例尺：5 μm。（f）来自TB染色的施万细胞密度定量分析。（g-i）有髓轴突直径、髓鞘厚度和G-比值的定量分析。数据为平均值±标准差；Tukey事后检验后采用单因素方差统计分析（每组n=3），ns表示无显著差异，p < 0.01，p < 0.001，***p < 0.0001表示显著性差异。

免疫荧光组织化学分析（图6）进一步证实了SF/GelMA/Ppy/KS对神经修复再生的促进作用。SF/GelMA/Ppy/KS组中轴突相关蛋白NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的荧光分布和阳性率均显著高于SF/GelMA/Ppy组，与自体移植组相似，表明该组再生神经对轴突再生、神经分化和成熟具有积极作用。在髓鞘修复方面，MBP染色显示SF/GelMA/Ppy/KS组MBP表达增强，髓鞘连续致密。在瘢痕和炎症调节方面，SF/GelMA/Ppy/KS组相较于SF/GelMA/Ppy组，促炎细胞因子TNF-α表达显著下调，抗炎细胞因子IL-10表达上调，促瘢痕生物标志物α-SMA、Col-I、TGF-β1表达降低。这些结果表明，KS通过调节局部炎症微环境抑制瘢痕形成，引导定向和完全的轴突生长，促进髓鞘成熟。

图6： 术后12周再生坐骨神经的免疫荧光组织学分析。（a-d）NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的免疫组织化学染色图像。（e-h）NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的定量分析。（i-k）MBP（髓鞘修复标志物）、IL-10和TNF-α（炎症相关标志物）以及α-SMA、Col-I和TGF-β1（瘢痕相关标志物）的免疫组织化学染色图像。（l-q）MBP、IL-10、TNF-α、α-SMA、Col-I和TGF-β1的定量分析。数据为平均值±标准差；Tukey事后检验后采用单因素方差统计分析（每组n=6），ns表示无显著差异，p < 0.01，p < 0.001，***p < 0.0001表示显著性差异。

综上所述，该研究通过结合丝素蛋白针织套管和多微通道SF/GelMA/Ppy水凝胶，成功构建了一种仿生复合神经引导导管，以应对长段周围神经缺损修复的关键挑战。其分层结构模拟了天然神经的机械支持和电活性微环境，而SF/GelMA基质构建了生物活性ECM模拟微环境，为神经再生创造了有利条件。研究发现，该导管具有适宜的机械稳定性和导电性，能够支持施万细胞增殖。针织KS在防止瘢痕干扰和促进有序轴突生长方面发挥关键作用，而导电水凝胶加速细胞和电信号传导。在大鼠5毫米坐骨神经缺损模型中，SF/GelMA/Ppy/KS组表现出显著改善的功能恢复。这种仿生复合神经引导导管为周围神经再生提供了一种有前景的策略。