10L 摇瓶生物反应器实现 rhA1AT 高效生产，细节全解析

摘要：α1-抗胰蛋白酶（A1AT）是临床刚需的生物制剂，传统血浆提取法一直受困于成本高、供应不稳定等瓶颈。近期一项研究带来了新希望：科研团队耗时12周筛选出高稳定性、高产量的CHO细胞单克隆株，并首次在10L一次性表面通气轨道摇瓶生物反应器（SB10-X）中，成功实现重组人A1AT（rhA1AT）的补料分批培养规模化生产。实验最高效价冲到了789mg/L，细胞比生产力也与摇瓶水平相当。更关键的是，研究还完成了rhA1AT的纯化与活性验证，这不仅为摆脱血浆依赖提供了可行方案，也为同类重组蛋白的工业化生产开辟了新思路。

一、临床刚需下，rhA1AT量产迫在眉睫

A1AT是人体里至关重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它的核心使命就是抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，守护我们脆弱的肺部肺泡组织。作为α1-抗胰蛋白酶缺乏症的唯一FDA批准治疗药物，它的地位无可替代。有趣的是，近年研究还发现了它的“隐藏技能”——抗炎和免疫调节，这让它在移植物抗宿主病、糖尿病等领域也展现出潜力。临床需求在持续攀升，但血浆提取法的短板太明显了。不仅供体资源有限，还存在潜在的病毒传播风险，规模化生产更是难上加难。开发重组蛋白生产工艺，已经成了行业必须迈过去的坎。

二、12周严苛筛选，锁定高优CHO细胞单克隆株

要做出好药，第一步得有好的“细胞工厂”。研究团队从rhA1AT生产细胞池中，先拿到了10株CHO单克隆细胞。为了找到最能打的那一个，他们进行了长达12周的严苛考验，分别在含300nM MTX和无MTX两种条件下，观察细胞的生产稳定性和生长特性（图1，来源：本文研究数据）。积分活细胞密度（IVCD）、比生长速率、相对比生产力，每一项都是硬指标。数据显示，不同克隆株的性能差异非常大：Clone 9的相对效价最高，而Clone 2则是“全能选手”，兼顾了高生长速率和稳定的生产力。最终，Clone 2凭借无可争议的综合实力，成为了后续规模化生产的核心细胞株（图2，来源：本文研究数据）。

图1：10株CHO细胞单克隆株的（a）IVCD、（b）比生长速率、（c）相对Clone 1的最高效价对比

图2：无MTX（a）和含300nM MTX（b）条件下，10株CHO单克隆株第0-12周的相对比生产力变化

三、10L反应器规模化生产，效价远超摇瓶水平

确定了Clone 2这个“种子选手”，下一步就是放大生产。团队先在摇瓶里做了预实验，最高活细胞密度达到1.17×10⁷cells/mL，收获效价437mg/L，这个数据其实已经不错了。真正的重头戏，是把工艺放大到10L SB10-X轨道摇瓶生物反应器。实验做了两次平行样，重点考验了设备对溶氧和pH的调控能力。结果很惊喜，溶解氧稳定维持在40%以上，pH也精准锁定在7.1±0.05。反应器里的细胞生长势头和摇瓶高度一致，最高活细胞密度甚至冲到了1.29×10⁷cells/mL（图3，来源：本文研究数据）。更关键的是，两次实验的最高效价分别达到789mg/L和729mg/L，比摇瓶水平提升了近80%。这组数据有力地证实了工艺的可放大性，完全超出了预期。

图3：摇瓶与10L SB10-X反应器两次实验的（a）活细胞密度与活力、（b）rhA1AT效价、（c-h）营养物与代谢物变化对比

四、rhA1AT的稳定性与纯化：解锁下游工艺关键要点

生产出来只是第一步，能不能稳定、能不能纯化，才是决定成本的关键。研究团队首先测试了pH稳定性，结果发现了一个重要特性：rhA1AT在pH7.0时最稳定，一旦pH降到3.0-5.0，可检测的蛋白量就会大幅下降（图4，来源：本文研究数据）。这意味着单抗生产中常用的低pH病毒灭活工艺，在这里根本用不了，后续必须开发干热或去污剂处理等替代方案。在纯化环节，团队设计了一套“深度过滤+两步层析”的工艺，再结合切向流过滤换液。最终的成果非常漂亮，HPLC检测呈现出单一的特征峰（图6，来源：本文研究数据）。纯化后，蛋白的弹性蛋白酶抑制活性从37%提升到65%并保持稳定（图5，来源：本文研究数据），回收率也达到了70%左右。这套工艺的有效性，算是被实打实验证了。

图4：pH3.0-7.0条件下，ELISA可检测的rhA1AT相对保留量

图5：未纯化、阴离子交换层析后、疏水相互作用层析+换液后rhA1AT的相对弹性蛋白酶抑制活性

图6：（a）rhA1AT细胞培养收获液、（b）纯化后rhA1AT的HPLC色谱图

五、亮点与展望：摇瓶反应器成生物制造新选择

聊到这里，这次研究最大的亮点其实已经很清晰了。那就是一次性表面通气轨道摇瓶生物反应器的首次应用。相比于传统的搅拌式生物反应器，这款设备操作起来简直太友好了，不仅简单，还能有效减少剪切力对CHO细胞的损伤。对于生物医药研发，尤其是早期临床生产来说，一次性耗材的设计大大降低了设备投入和清洁成本，性价比极高。

当然，工艺还有优化的空间。比如乳酸、铵离子等代谢物的积累，还是会影响细胞的存活时间。后续可以从营养配比、补料策略，甚至培养温度、渗透压这些细节入手，进一步延长培养周期，把效价再往上推一推。整体来看，这项研究搭建起了从细胞株筛选到10L规模生产，再到纯化验证的rhA1AT完整生产工艺。它不仅为rhA1AT的低成本量产奠定了基础，也给整个重组蛋白生物制造领域，提供了一个极具参考价值的新范式。

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