62个候选基因筛选，解锁生物制药高效生产新密码

摘要：CHO细胞是生物制药中重组蛋白生产的核心宿主，但宿主细胞蛋白（HCPs）作为工艺杂质，会增加下游纯化成本、影响产品安全性。本研究通过蛋白质组学筛选出高丰度、难去除的HCPs，利用CRISPR多重基因敲除技术，在CHO细胞中实现了最多11个HCP相关基因的敲除，最终使分泌型HCPs水平降低57%~85%，且未损害细胞生长和产率，其中纤连蛋白1（FN1）敲除还能显著提升培养性能，为生物制药高效、清洁生产提供了全新的工程化CHO细胞底盘。

一、CHO细胞的“杂质痛点”，生物制药的卡脖子难题

作为重组治疗性蛋白生产的主力军，CHO细胞凭借高产能、人源化翻译后修饰等优势，支撑了绝大多数获批生物药的生产。但生产过程中释放的宿主细胞蛋白（HCPs），是最头疼的工艺相关杂质。这些蛋白不仅会给细胞带来代谢负担，还会增加下游纯化的难度和成本，微量残留甚至可能影响药物稳定性、引发患者免疫反应，成为生物制药生产的一大痛点。传统下游纯化能去除大部分HCPs，却对部分高丰度、难清除的HCPs束手无策，从上游改造细胞减少HCPs，成了行业的重要研究方向。

二、精准定位！找出该敲除的“问题HCPs”

要改造细胞，首先得找准目标。研究团队对不同克隆、不同产品的CHO细胞培养上清，以及下游纯化各步骤的样品做了蛋白质组学分析，用LC–MS/MS鉴定出1254种HCPs，最终筛选出67种“核心HCPs”——它们仅占总种类的5%，却贡献了63%的总HCP质量，是代谢负担的主要来源。

同时团队发现，经Protein A捕获、离子交换层析等标准纯化步骤后，仍有PRDX1、CLU等HCPs持续残留，这类难去除的蛋白也被纳入敲除候选名单。结合能量成本分析和纯化持久性，研究最终确定了71个HCP相关候选基因，为后续敲除筛选打下基础。

三、层层筛选！62个基因里挑出36个“安全敲除靶点”

确定候选基因后，团队用CRISPR/Cas9技术，通过混合敲除和单细胞敲除两种方式，对62个可实验的候选基因进行筛选（9个因技术问题未评估）。研究设置了严格的筛选标准：敲除后细胞需保持正常的生长活力和蛋白产率，且敲除效率稳定（传代过程中敲除评分漂移不超过10%）。

实验中发现，部分基因如GAPDH、EEF1A1是细胞必需的，敲除后细胞无法存活或增殖受阻；而另一部分基因敲除后，细胞性能未受影响甚至提升。最终从62个基因中，筛选出36个适合进行宿主细胞简化的有效靶点，这些靶点敲除后不会对CHO细胞的核心生产性能造成负面影响。

四、意外惊喜！FN1敲除，既减杂质又提生产性能

在筛选过程中，纤连蛋白1（FN1）敲除成为最大的惊喜。团队将FN1敲除引入4个不同的NISTmAb生产CHO克隆，发现敲除后细胞的培养稳定期显著延长，活力下降速度明显放缓，葡萄糖代谢和乳酸分泌却未发生明显变化。

这种表型直接带来了生产效益的提升：FN1敲除株的积分活细胞浓度（IVCC）更高，培养时长延长，最终重组蛋白滴度平均提升30%以上。这一效果在不同克隆中均能重现，说明FN1敲除是提升CHO细胞生产性能的通用策略，也让其成为后续多重敲除的核心靶点之一。

五、多重敲除！7基因编辑实现58% HCPs降低

基于筛选出的靶点，研究团队率先开展了7重基因敲除，靶向BGN、FN1、LPL等7个高丰度/难去除的HCP相关基因，这些基因对应的蛋白约占总HCP质量的15%。通过CRISPR RNP复合物共转染，获得了敲除效率均超80%的细胞池，经单细胞克隆后，得到了4重至7重敲除的不同克隆株。

7重敲除株在补料分批培养中，展现出和FN1单敲除相似的延长稳定期表型，且在培养第7天，分泌型HCPs水平较野生型降低58%，远高于预期的15%。这说明多重敲除不仅能直接去除靶向蛋白，还会通过干扰细胞外基质分泌等途径，间接减少其他HCPs的释放，产生“叠加效应”。

六、升级改造！11重敲除将HCPs降低至85%

在7重敲除的基础上，研究团队以高产能的6重敲除克隆为底盘，继续敲除HSP90AA1、CLU等4个基因，实现了11重基因敲除，其中CLU还是典型的难去除HCPs。尽管因2个靶点敲除效率稍低，仅获得4株纯合11重敲除克隆，但这些克隆仍保持了良好的细胞活力。

培养第11天，11重敲除细胞池的HCPs水平较野生型降低85%，敲除克隆也实现了57%的降低，且部分克隆仍保持了较高的重组蛋白产率。这一结果证实，CHO细胞能耐受至少11个HCP相关基因的敲除，多重基因编辑的策略具有良好的可扩展性。

七、研究启示，清洁CHO细胞的未来应用

这项研究的成果，为生物制药生产带来了多重价值。首先，上游基因编辑从源头减少HCPs，能大幅降低下游纯化的压力，甚至可能简化纯化步骤，降低生产总成本；其次，FN1等基因的敲除，实现了“减杂质+提产率”的双重效果，让工程化CHO细胞的生产效率更高；另外，敲除株保留了CHO细胞的核心生产特性，能适配现有工业生产平台，产业化转化的难度较低。

当然研究也发现，培养后期的细胞裂解会释放胞内蛋白，抵消部分敲除带来的HCPs降低效果。后续可结合早收获工艺或抗凋亡基因编辑，进一步减少后期HCPs的释放。而此次筛选出的36个安全靶点，也为后续开发更优的清洁CHO底盘细胞，提供了丰富的基因编辑组合选择。

八、总结

从蛋白质组学精准筛靶，到CRISPR多重基因编辑，这项研究成功打造了一款“清洁型”CHO细胞底盘，通过最多11个基因的敲除，实现了HCPs水平57%~85%的降低，且未牺牲细胞生长和产率，还意外发现FN1敲除能显著提升生产性能。这一研究不仅为解决生物制药的HCPs杂质难题提供了全新方案，也为CHO细胞的理性工程化改造提供了重要的靶点库和技术思路，未来随着技术的进一步优化，清洁CHO细胞有望成为生物制药生产的新一代核心宿主，推动行业向更高效、更清洁、更安全的方向发展。

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