FSHW | 辣木籽异硫氰酸酯通过调控p38MAPK介导的自噬抗皮肤光老化机制研究

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Introduction

皮肤光老化（Skin Photoaging）是一种最常见的高原性皮肤病，是可以预防和治疗的皮肤老化性疾病。常见临床表现为皮肤弹性丧失、表皮萎缩、深浅皱纹、皮革样外观、异常色素沉着（雀斑、黄褐斑等）。皮肤光老化不仅严重有损人的外貌美观及精神生活质量，而且与皮肤癌的发生有着病因学的关联，严重危害人类健康。大量研究表明，自噬活性异常降低是导致光老化的重要原因。角质细胞中自噬缺失时，氧化应激、DNA损伤和细胞老化现象增加。UV长期辐射下皮肤细胞中溶酶体功能异常、自噬活性明显降低，导致多种细胞功能紊乱，加剧衰老过程。

研究表明，紫外辐射产生的ROS通过激活MAPK上游激酶MKK6，可以促进p38MAPK激酶磷酸化。因此p38MAPK是MAPK中最容易被紫外线刺激，且对ROS极为敏感的一类激酶。活化后的p38MAPK激酶将激活下游转录因子异二聚体激活蛋白1（AP-1），AP-1能够促进胶原酶MMP1和MMP9的分泌表达，从而分解皮肤细胞外基质，降解皮肤胶原蛋白，加重皮肤光老化损伤。同时p38MAPK也是调控自噬的关键酶类，UV辐射后p38MAPK激酶表达增加，自噬水平降低，从而加剧UV辐射后皮肤发生的炎症反应。这些研究结果提示，UV可能通过激活p38MAPK活性，抑制自噬水平，诱导细胞凋亡进而导致皮肤光老化。因此，降低p38MAPK活性，提高自噬活性，对抗凋亡，对于延缓UV引起的光老化进程有重要作用。

辣木（Moringa oleifera Lam.）为辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，富含多种营养素，且具有多种药理活性。其中异硫氰酸酯是主要活性成分之一，且辣木籽中含量最高（2%~4%）。异硫氰酸酯是一类含硫的植物次级代谢产物，广泛存在于十字花科芸苔属植物中。目前异硫氰酸酯化合物主要分为：苯乙基异硫氰酸酯、甲苯基异硫氰酸酯、苯丙基异硫氰酸酯、苯乙烯苄酯、烯丙基异硫氰酸酯、莱菔硫烷等。大量研究报道异硫氰酸酯化合物具有抗癌、抗炎、修复心脏代谢、保护神经系统、调节血脂和预防糖尿病的活性。辣木异硫氰酸酯与其它十字花科植物中的异硫氰酸酯化合物具有相同的药效基团，但由于辣木异硫氰酸酯中存在芳香环和鼠李糖部分，其生物活性及化学稳定性要高于其它植物中的异硫氰酸酯化合物。辣木中含有4 种独特的异硫氰酸酯，它们均具有很强的生物活性，其中4-[(α-L-鼠李糖氧基)苄基]异硫氰酸酯（MITC）的含量最高，活性最好。本团队前期发现MITC具有抗皮肤光老化的活性，但具体机制尚不清楚。

因此，云南农业大学食品科学技术学院盛军教授和田洋教授团队联合广东医科大学欧阳茜茜博士在本文以辣木籽异硫氰酸酯为研究对象，构建动物光老化模型和细胞光老化模型测定了其通过调控p38MAPK通路介导自噬抗皮肤光老化的分子作用机制研究。

摘要图

Results and Discussion

MITC在体内可减轻紫外线照射引起的皮肤光老化损伤

紫外线辐射可以穿透真皮层，部分可以到达皮下层，这被认为是导致皮肤光老化的主要因素。为了研究MITC对紫外线诱导的光老化的影响，作者用ICR小鼠测量脱毛后的皱纹形成和皮肤状况。结果表明，紫外线照射后，小鼠表面皮肤出现明显的起皱、脱皮和红斑，组织结构受损，包括皮肤弹性丧失，皮肤角化严重，红斑和皱纹增加，表皮和真皮层厚度增加。反复的紫外线照射会导致皮肤的结构变化。然而，在紫外线照射下，模型小鼠的皮肤出现了结构变化。紫外线照射导致小鼠皮肤弹性丧失，而MITC处理恢复了小鼠皮肤弹性水平。与UV组相比，正常小鼠皮肤结构相对完整，MITC处理改善了皱纹的平均长度和深度。

图1 MITC缓解紫外线照射下小鼠皮肤的光老化 (A) MITC提取物鉴定及分子结构式 (B)各组小鼠背侧皮肤表型分析。(C) 小鼠背侧皮肤弹性恢复实验。(D) HE染色的皮肤切片组织学图像

MITC减轻紫外线诱导的小鼠皮肤光老化，并与体内MMP反应和氧化应激有关

与对照组相比，紫外线组真皮上部的胶原纤维水平降低，真皮纤维扭曲和紊乱，毛囊减少，毛孔关闭增加。相比之下，MITC处理减轻了胶原修复小鼠真皮胶原纤维，表明MITC抑制了紫外线诱导的小鼠皮肤胶原降解。同时，紫外线诱导的MMP-1和MMP-3的表达分别降低了3.2 倍和4.9 倍。经MITC修复后，小鼠皮肤表面皱褶减轻，皮肤光滑。胶原水解蛋白酶表达下调，皮肤胶原水解程度降低并恢复。综上所述，MITC可以减轻光老化小鼠皮肤中MMP-1和MMP-3的含量，从而抑制MMPS引起的皮肤胶原蛋白降解程度。此外，经MITC处理后，小鼠皮肤中HA和HYP的含量也显著增加，说明小鼠皮肤的含水率和含水度得到改善。

图2 MITC通过调控体内MMP反应和氧化应激发挥抗光老化作用。 (A)小鼠皮肤切片Masson染色图像 (B) 小鼠皮肤Masson染色中胶原含量的定量分析 (C) 小鼠皮肤MMP-3免疫组化染色组织学图像 (D)小鼠皮肤MMP-3免疫荧光定量分析 (E) 小鼠皮肤MMP-1免疫组化染色组织学图像 (F)小鼠皮肤MMP-1免疫荧光定量分析 (G) ELISA法测定皮肤HA表达水平 (H) ELISA法测定皮肤中HYP表达水平 (I)小鼠皮肤SOD的表达水平 (J) 小鼠皮肤CAT的表达水平 (K) ELISA法测定皮肤MMP-1表达水平 (L) ELISA法测定皮肤MMP-3的表达水平。

MITC通过抑制p38MAPK通路的激活和促进自噬来改善小鼠皮肤光老化

为了确定MITC改善小鼠抗光老化的潜在生物学过程和途径，本研究进行了RNA-seq分析。结果显示，UV诱导小鼠MAPK通路相关基因表达上调，而MITC处理显著下调MAPK通路相关基因表达。这表明MITC干预可能通过抑制MAPK信号通路发挥其抗光老化作用。为了确定MAPK通路在MITC缓解皮肤光老化中的作用，本研究采用Western blotting技术检测MAPK信号通路和自噬通路中关键蛋白的表达水平。结果表明，MITC通过调节MAPK通路减轻了紫外线诱导的小鼠皮肤光老化。有趣的是，与JNK和ERK蛋白相比，MITC对p38MAPK蛋白有很强的调节作用。此外，紫外线损伤的体内模型中P62和mTOR的表达低于紫外线组，而LC3I/LC3II的比值高于紫外线组。结果表明，MITC能提高紫外光照射后小鼠体内自噬水平。本研究揭示p38MAPK和自噬通路可能作为紫外线诱导的皮肤光老化调控通路，在MITC缓解皮肤光老化的机制中发挥重要作用。

图3 MITC通过抑制体内p38MAPK通路和自噬通路的激活改善光老化 。(A) 小鼠皮肤Pearson相关性 (B) UV和UV+MITC组间的KEGG富集分析 (C) 小鼠皮肤差异表达基因热图 (D) Western blotting检测p38MAPK、P-p38MAPK、JNK、P-JNK、Erk、p-Erk、β-actin蛋白表达水平 (E) 利用ImageJ对p38MAPK、P-p38MAPK、JNK、P-JNK、Erk、p-Erk进行定量分析 (F) Western blotting检测p-mTOR、P62、LC3I、LC3II蛋白表达水平 (G)利用ImageJ对p-mTOR、P62、LC3I、LC3II进行定量分析

MITC通过恢复抗氧化酶活性，降低紫外线照射诱导的细胞中MMPs高表达

细胞是构成生物体的最基本结构，生物体的衰老过程往往伴随着细胞衰老的发生。在本研究中，用紫外线诱导的HaCaT细胞光老化模型来测定MITC的体外抗光老化活性。结果表明MITC对HaCaT细胞无毒性作用，正常HaCaT细胞呈梭状生长，但紫外线照射后细胞起皱，细胞膜破裂，胞内胞浆暴露，经MITC处理后修复。由于先前的研究表明，抗氧化酶通过清除活性氧来保护皮肤免受紫外线引起的光损伤，因此本研究测量了SOD和CAT的活性。结果表明，与对照组相比，持续紫外线照射后，CAT和SOD活性显著降低。然而，当使用MITC处理时，紫外线照射引起的CAT和SOD的下降逐渐减轻。

图4 MITC恢复紫外线照射诱导的细胞抗氧化活性，降低MMPs高表达。 (A) MITC改善紫外线诱导的HaCaT细胞增殖抑制作用 (B) MITC改善紫外线诱导的HaCaT细胞形态学改变(C) 细胞内SOD表达水平(D) 细胞内CAT表达水平 (E) 细胞内MMP-1表达水平 (F) 细胞内MMP-3的表达水平。

MITC可以降低紫外线照射后细胞的ROS水平，抑制细胞凋亡

根据自由基衰老理论，ROS积累引起的氧化应激可直接与脂质、蛋白质和核酸相互作用，或通过一系列信号通路促进细胞衰老，被广泛认为是介导皮肤衰老的核心机制之一。过表达的MMPs刺激ROS分泌，加速皮肤氧化损伤。紫外线照射后细胞中ROS水平明显升高，但MITC处理可促进细胞内ROS含量减少。此外，过量ROS也会导致细胞凋亡，而MITC处理能够减少细胞凋亡。线粒体膜电位在细胞凋亡和ROS生成中起重要作用。进一步观察MITC对紫外光诱导HaCaT细胞的影响，损伤细胞经过紫外线照射后，绿色荧光强度远高于对照组。但经MITC处理后，红色荧光增强，绿色荧光减弱，绿红荧光比值降低。这些结果表明，细胞的抗氧化作用与线粒体功能的恢复有关。随后，作者发现紫外线照射可以显著增加HaCaT细胞的ROS释放，促进细胞凋亡。经MITC处理后，ROS水平降低细胞凋亡率降低。

图5 MITC可降低紫外线照射后细胞的ROS水平，抑制细胞凋亡。 (A) HaCaT细胞中ROS的表达情况 (B)细胞中ROS免疫荧光水平定量分析 (C) HaCaT细胞凋亡情况 (D)细胞凋亡比例定量分析 (E)紫外线和MITC处理HaCaT细胞的线粒体膜电位测试。

MITC通过调节p38mapk依赖的自噬途径改善体外光老化

自噬是一种高度保守的降解机制，广泛存在于从酵母到高等脊椎动物的细胞中，它可以去除受损的细胞器和生物分子，如蛋白质和脂质，以维持内环境稳态。研究表明自噬与衰老密切相关，具有许多共同特征，自噬激活可延缓衰老，自噬相关基因过表达可抑制应激诱导的细胞衰老。此外，自噬参与了皮肤老化的调节，MAPK信号通路可能是皮肤老化和自噬之间的潜在联系。为了进一步验证MITC具有抗光老化活性，用不同剂量的MITC处理紫外线损伤细胞。在本研究中，与对照组相比，紫外线照射后HaCaT细胞中p38MAPK的表达增加，而MITC处理后p-p38MAPK的表达明显降低。AP-1蛋白也显示出一些与p38MAPK相似的结果。与UV组相比，MITC显著下调p38MAPK蛋白表达，且呈剂量依赖性。紫外线损伤HaCaT细胞中LC3、P62和mTOR的表达高于对照组。共聚焦荧光显微镜显示MITC处理促进了紫外线诱导细胞中LC3的表达。结果表明，MITC可增加紫外线照射后光老化细胞模型的自噬水平。

图6 MITC通过调节p38MAPK依赖性自噬途径改善皮肤光老化。 (A) Western blotting检测p-p38MAPK、AP-1、β-actin蛋白表达水平 (B) 利用ImageJ对p-p38MAPK、AP-1、β-actin进行定量分析 (C) Western blotting检测p-mTOR、P62、LC3I、LC3II蛋白表达水平 (D)利用ImageJ对p-mTOR、P62、LC3I、LC3II进行定量分析 (E) 免疫荧光共聚焦染色测定HaCaT细胞中LC3表达情况。

结论

综上所述，反复紫外线照射会导致皮肤组织产生大量活性氧，最终导致细胞衰老和凋亡。最近的研究发现，MITC可以显著抑制体内和体外光老化降低ROS水平。此外，根据之前的研究和最近的实验结果，作者推测MITC可以抑制UV诱导的ROS产生，从而抑制p38MAPK的活性。激活自噬通路，抑制细胞凋亡，发挥抗皮肤光老化作用。本研究不仅为MITC作为一种新的抗光老化食品原料的开发提供了理论和实验基础，也证实了p38MAPK介导的自噬信号通路可能是缓解皮肤光老化的潜在治疗靶点，同时也为辣木籽的高价值利用和开发提供了新的思路。

总结图

第一作者简介

杨敏，云南农业大学食品科学技术学院2021级博士研究生，中共党员。以第一作者身份在Trends in Food Science and Tecnology，Food Science and Human Wellness等SCI期刊发表学术论文7 篇，授权实用专利5 项，获得国家奖学金、云南省三好学生等荣誉称号。

通信作者简介

盛军，二级教授，日本大阪大学博士，原卫生部长春生物制品研究所所长、原云南农业大学校长、云南省高原特色农业产业研究院院长；现任中国微生物学会常务理事，云南省微生物学会理事长，教育部高等学校教学指导委员会委员。长期从事食药资源组学研究、功能机理解析和成果转化，在植物基食品组学、功能活性成分解析以及精准营养产品上取得系列成果。破译特色植物资源基因组，构建了国际上首个食药同源资源跨组学数据；创建跨界物种植物多酚生物合成大数据，揭示植物基食物多酚调节代谢免疫机制。建立了植物基功能组分定向发酵富集技术，创新集成工艺装备，建成普洱茶、辣木、核桃等深加工技术体系，研制系列新产品，并实现产业化推广应用，产生了显著的经济效益和社会效益。获授权专利73 件，发表论文309 篇（SCI论文160 篇），以第一或通信作者在Science、Nature Communications、Molecular Plant等杂志上发表论文138 篇，出版学术著作4 部。获吉林省科技进步一等奖、云南省科技进步一等奖、云南省科技进步特等奖、云南省科学技术杰出贡献奖、世界茶业大会普洱茶特别贡献奖；入选云南省科技领军人才、首批国家跨世纪百千万人才工程国家级人选、全国优秀科技工作者。

田洋，教授，博士生导师，长期从事食药同源资源加工与高值化利用研究，围绕辣木、核桃、三七、铁皮石斛等生物资源，在组学数据解析与品质形成机理、功能组分与功效机制、加工理论与技术创新等领域取得系列创新性成果，构建营养健康导向的食药同源资源设计加工与高值化利用技术体系，为食药同源资源高值化开发利用提供新策略。主持建立食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心等科研平台，获国家现代农业产业技术体系辣木产品加工岗位科学家，神农青年英才支持计划，云南省“兴滇英才支持计划”产业创新人才，云南省“兴滇英才支持计划”食药同源功能食品创新团队，云南省中青年学术和技术带头人，云南省青年科技奖，中国食品科学技术学会杰出青年奖等。主持国家自然科学基金及省重大科技专项等10余项；发表学术论文210余篇，以第一或通信作者在Trends in Food Science & Technology、Food Hydrocolloids、International Journal of Biological Macromolecules等国际知名期刊发表SCI论文50余篇，授权国家专利65 件，制定国家或行业标准6 项，出版著作或教材6部；荣获云南省科技进步一等奖1 项，三等奖2 项，梁希林业科学科技进步三等奖1 项，云南省教学成果二等奖1 项。

欧阳茜茜,博士，广东医科大学，讲师。主要从事海洋生物活性肽的基础研究与营养健康产品开发及海洋生物多糖材料的资源开发与利用。主持广东省中医药局科研项目、广东省药品监督管理局科技创新项目、广东省普通高校特色创新类项目、湛江市科技发展专项资金竞争性分配项目、广东省医学科学技术研究基金等课题7项，指导本科生获得3 项广东省大学生创新创业训练计划项目，以第一或通信作者在Food Chemistry，Carbohydrate Polymer，International Journal of Biological Macromolecules，Reactive Functional Polymers，Marine Drugs等期刊上发表研究论文12 篇，获得授权发明专利4 件。

Moringia oleiferaLam. seeds isothiocyanate against skin photoaging by regulating p38 MAPK-dependent autophagy signalling pathway

Min Yanga,b,c,1, Lingyan Sua,1, Liang Taoa,b,c, Lingfei Lia,b, Yijin Wanga, Zilin Wanga,b, Cunchao Zhaob,c, Qianqian Ouyangd,e,*, Jun Shengb,c,*, Yang Tiana,b,c,f,*

a College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

b Engineering Research Center of Development and Utilization of Food and Drug Homologous Resources, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

c Yunnan Key Laboratory of Precision Nutrition and Personalized Food Manufacturing, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

d Marine Biomedical Research Institution, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China

e The Marine Biomedical Research Institute of Guangdong, Zhanjiang 524023, China

f PuEr University, Puer 665000, China

1 These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors.

Abstract

People living long-term in areas with UV will cause premature photoaging. An abnormal reduction in autophagy is a key feature of photoaging, and p38 MAPK has been regarded as a key regulator of autophagy. Isothiocyanate is one of the main active components of Moringa oleifera Lam. seeds. Studies have reported that M. oleifera Lam. seeds isothiocyanate (MITC) has anticancer, anti-inflammatory, cardiometabolic repair, nervous system protection, blood lipid regulation and diabetes prevention properties. However, the molecular mechanisms of MITC with protective effects against skin photoaging have not been studied thus far. In this study, we aimed to evaluate the antiphotoaging activity of MITC and to investigate the effect of p38 MAPK-dependent autophagy in vivo and in vitro models of photoaging. In this research we found that MITC can reverse the intracellular reactive oxygen species (ROS) content and inhibit the activation of p38 MAPK to improve the autophagy level, reduce the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), and finally protect against photoaging by UV. Our results will uncover the molecular mechanisms of MITC that play a role in the protective effects against skin photoaging, provide helpful information for developing MITC as an anti-photoaging plant material and improve the utilization of M. oleifera Lam. seeds.

Reference:

YANG M, SU L Y, TAO L, et al.

Moringia oleifera

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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