Cell Stem Cell | 非病毒LNP递送系统实现原位修复与功能恢复

撰文|亦

先天性鱼鳞病（Autosomal recessive congenital ichthyosis ，ARCI）目前缺乏有效治疗手段，现有疗法主要依赖耗时的症状管理（如每日长时间护理、系统性维A酸使用）【1，2】，无法根治疾病。近年来，基于基因增强和蛋白质替代的策略虽有一定进展，但多采用病毒或非病毒载体进行递送【3，4】，存在免疫原性高、包装能力有限、易引发插入突变或基因表达失调等问题。CRISPR基因编辑技术的发展为精准纠正致病突变提供了新可能，但目前在皮肤疾病领域的应用仍多局限于细胞模型或动物实验【5，6】，缺乏针对人类皮肤复杂结构与屏障功能的原位编辑策略，且病毒载体的长期表达特性不利于基因编辑的安全性控制。因此，亟需开发一种安全、高效、可局部递送的非病毒基因编辑系统，实现对人皮肤疾病的原位纠正。

2026年1月27 日，柏林健康研究所Sarah Hedtrich团队在Cell Stem Cell上发表题为LNP-based non-viral in situ gene editing of the congenital ichthyosis-causing mutations in human skin models的文章。提出 一种基于激光辅助的脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，用于在人类皮肤模型中原位纠正导致ARCI的TGM1 c.877-2A>G剪接位点突变，并在体内外都证实了该LNP系统的良好安全性、低免疫原性及无系统性分布特性 。

精确纠正TGM1剪接位点突变c.877-2A>G 的 挑战在于目标碱基旁存在一个关键的“旁观者”核苷酸，若被编辑会产生非功能序列。为此，研究比较了标准编辑器BE4max与两种新一代窄窗口编辑器eTD-CBE和eA3G-CBE，并优化了总RNA剂量及mRNA/sgRNA比例。结果发现， eTD-CBE在目标位点实现了最高约26%的编辑效率，且完全避免了旁观者编辑 。 而总RNA剂量在3-10 µg时编辑效率达到平台期，更高的sgRNA比例虽略微提升编辑但伴随细胞毒性 。这为后续实验选定了eTD-CBE作为最佳编辑器并确定了安全的RNA剂量范围。

为了在模拟人类皮肤组织复杂结构的模型中评估基因编辑疗效，研究利用携带TGM1突变的患者细胞构建了3D ARCI皮肤疾病模型。通过免疫荧光、屏障渗透实验、原位酶活染色及蛋白质组学分析，系统比较了正常与ARCI模型的表型差异。结果证实，ARCI模型表皮分化受损（filaggrin、involucrin等标志物表达降低）、组织结构紊乱、皮肤屏障功能缺陷，并且完全丧失了TG1酶活性，蛋白质组学也显示TGM1、KRT10等屏障相关蛋白表达显著下调，成功模拟了疾病的关键病理特征。

为了克服皮肤角质层对生物大分子的递送屏障，研究将临床已批准的激光微消融技术与反射共聚焦显微镜结合，在皮肤上制造精确深度的微孔以递送LNP。通过剂量反应曲线确定在人类皮肤和ARCI模型中， 7 µg总RNA可实现最优的原位编辑效率 （约7.36%和平均12%的基因纠正）。重要的是， 在该剂量下未检测到旁观者编辑，且脱靶编辑分析（包括NGS、CAST-seq和R-loop assay）显示编辑特异性极高，仅在一个非编码区检测到<1%的极低水平离靶事件 。功能上， 3 µg总RNA处理即可最高效地恢复TG1酶活性 ，蛋白质组学分析也证实了全长TGM1蛋白的表达及相关皮肤分化标志物的有益变化。

鉴于皮肤是高免疫原性器官，还需要评估LNP制剂在皮肤相关免疫细胞和新鲜人皮肤组织中的免疫激活潜力。研究用不同载药（如未修饰mRNA、修饰mRNA、RNP）和不同脂质组成的LNP刺激人单核细胞源性树突状细胞（MoDCs），并以COVID-19 mRNA疫苗和病毒载体疫苗为参照。结果发现， 载有RNP或未修饰mRNA的DOPE-LNP能显著上调MoDCs的MHC II类及CD40/CD86共刺激分子表达，而本研究的主导LNP H制剂即使载有未修饰mRNA也未引发显著免疫反应。将LNP局部应用于新鲜人皮肤后，也未观察到迁移免疫细胞激活或促炎细胞因子释放，表明LNP H具有优异的免疫相容 。

为全面评估原位基因编辑疗法的安全性，尤其是局部给药后LNP及其载体的全身生物利用度，研究在小鼠体内进行了毒性实验。通过调整激光参数和设计针对小鼠Tgm1同源序列的sgRNA，评估了单次和重复给药（最高30 µg RNA/只）后的局部耐受性、全身毒性及器官分布。结果显示，治疗未引起小鼠死亡、体重变化或局部皮肤刺激，组织学检查也未发现中度或强烈的局部免疫反应或白细胞浸润。活体成像和DESI-MSI代谢成像分析证实，荧光信号和LNP特异性脂质离子仅存在于处理部位的皮肤中，在心、肝、脾、肺等其他器官均未检测到显著积累，表明 LNP及其遗传货物无全身性分布，具有良好的局部安全性 。

总的来说， 本研究成功开发了一种基于激光辅助、非病毒LNP递送的原位基因编辑策略，在高度模拟人体皮肤结构的三维ARCI疾病模型中，实现了对最常见致病突变TGM1 c.877-2A>G的高效、精准纠正，并恢复了约30%的TG1功能酶活。安全性评估表明，该LNP系统具有极低的免疫原性、优异的局部耐受性，且无全身性分布风险。 这项研究首次在人类皮肤疾病模型中完成了从突变纠正到功能恢复的全链条验证，不仅为目前缺乏根治手段的先天性鱼鳞病提供了首个潜在治愈性疗法方案，更建立了一个安全、微创、可局部应用的基因编辑技术平台，为治疗其他遗传性皮肤病乃至需要局部精准递送的基因治疗领域，开辟了全新的转化路径。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2026.01.001

制版人： 十一

参考文献

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