药学2区（4.7）-Int Immunophar-冬凌草乙素通过双重抑制RIPK1介导的神经炎症和坏死性凋亡改善阿尔茨海默病

【写在前面】：本期推荐的是由成都中医药大学、中国科学院昆明植物研究所等研究团队合作近期发表于International Immunopharmacology(IF4.7）的一篇文章，揭示冬凌草乙素通过双重抑制RIPK1介导的神经炎症和坏死性凋亡改善阿尔茨海默病。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Ponicidin ameliorates Alzheimer's disease through dual inhibition of RIPK1-mediated neuroinflammation and necroptosis

冬凌草乙素是从冬凌草中分离得到的一种二萜类化合物，具有广泛的药理活性，包括抗炎作用。然而，其在阿尔茨海默病中的治疗潜力，特别是在调控受体相互作用蛋白激酶1介导的神经炎症和坏死性凋亡方面的作用，尚未得到充分探索。本研究旨在探讨冬凌草乙素靶向RIPK1以缓解AD发病机制的途径。通过生物膜层干涉技术和药物亲和反应靶点稳定性实验，证实了冬凌草乙素与RIPK1之间的相互作用。在体外，使用酶联免疫吸附测定、逆转录实时定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹法和流式细胞术，评估了冬凌草乙素对BV2小胶质细胞和HT22海马神经元细胞的炎症反应及坏死性凋亡的影响。在体内，通过对5×FAD转基因AD模型小鼠进行行为学测试、组织学分析和生化检测，评估了冬凌草乙素的治疗效果。研究发现，冬凌草乙素能以高亲和力与RIPK1结合，并增强RIPK1对蛋白水解降解的抵抗能力。在小胶质细胞中，冬凌草乙素通过破坏RIPK1-JAK1-STAT1信号通路，有效抑制了促炎细胞因子IL-6和TNF-α的释放。在神经元中，冬凌草乙素通过阻断RIPK1-RIPK3-MLKL级联反应，抑制了RIPK1介导的坏死性凋亡。对5×FAD小鼠的行为学分析表明，冬凌草乙素治疗能显著改善认知功能，减少脑内β-淀粉样蛋白斑块沉积，并减轻神经炎症和坏死性凋亡。冬凌草乙素通过靶向RIPK1，对AD中两个关键的病理过程——神经炎症和坏死性凋亡——产生双重神经保护作用。这些发现凸显了冬凌草乙素作为AD疾病修饰疗法的潜力，并为天然产物来源的RIPK1抑制剂在神经退行性疾病中的临床开发提供了基础。

【前言】

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性、致残性的神经退行性疾病，主要表现为记忆丧失、认知功能障碍和行为异常。AD的标志性病理特征包括β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积和由Tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结形成。然而，越来越多的证据表明，这些经典病理的发生和发展并非仅由蛋白质聚集引起，而与神经炎症的慢性激活和神经元死亡密切相关。目前AD的标准治疗主要包括胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏）和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂（如美金刚）。虽然这些疗法能够缓解症状，但无法阻止或逆转疾病进展。近年来，抗Aβ单克隆抗体（如仑卡奈单抗和多奈单抗）作为疾病修饰疗法显示出一定潜力。然而，其临床应用受限于高昂的成本、复杂的给药方案以及脑水肿和出血等安全性问题，且其神经保护作用相对有限。因此，迫切需要探索新的病理机制和分子靶点，以开发更安全、更有效的AD治疗策略。

慢性神经炎症在AD发病机制中起关键作用。活化的小胶质细胞和星形胶质细胞释放一系列促炎细胞因子，包括白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。这些细胞因子通过JAK1/STAT1通路传递炎症信号，诱导下游基因转录并放大炎症反应。在AD患者和动物模型中，JAK1/STAT1通路常被过度激活，特别是STAT1磷酸化水平升高，从而维持胶质细胞的促炎表型，加剧神经炎症。抑制JAK1/STAT1信号已被证明可以减轻胶质细胞过度活化，促进Aβ清除，并改善突触功能和认知缺陷。重要的是，受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）已成为这一炎症级联反应中的关键上游分子，作为细胞死亡和炎症信号交汇点的核心调控因子。在AD小胶质细胞中，异常的RIPK1激活促进了促炎细胞因子的释放，并通过JAK1/STAT1信号放大炎症，形成神经炎症的恶性循环。

除了炎症，坏死性凋亡——一种受调控的程序性细胞死亡形式——已被认为是导致AD神经元丢失的主要机制。该过程由死亡受体信号（如TNF-α/TNFR1）触发，并依赖于RIPK1激酶活性：当凋亡被阻断时，RIPK1与RIPK3相互作用并募集MLKL，形成坏死小体复合物，最终导致细胞膜破裂和细胞内容物释放。与凋亡不同，坏死性凋亡会释放大量损伤相关分子模式（DAMPs），进一步加剧炎症。研究表明，在AD患者大脑中，RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平显著升高，且与磷酸化Tau蛋白的积累以及Braak分期进展相关。此外，RIPK1水平与脑重量和认知功能呈负相关，表明其异常激活加速了神经元丢失。在临床前模型中，Aβ寡聚体负荷的增加与pMLKL表达升高有关，并且通过基因或药理学方法抑制坏死性凋亡均能有效缓解Aβ诱导的神经元变性和认知障碍。此外，由Aβ激活的小胶质细胞释放的TNF-α可通过TNF/RIPK1轴诱导神经元坏死性凋亡，阻断该通路能有效防止神经元损伤。这些发现突显了AD中炎症与坏死性凋亡的相互促进关系，而RIPK1则充当了二者的关键枢纽。动物模型研究进一步支持了抑制RIPK1激酶活性可显著减轻炎症、保护神经元并改善AD样病理和认知功能的观点。目前已有数种小分子RIPK1抑制剂进入临床开发阶段，其中包括可渗透脑屏障的抑制剂SAR443060（DNL747），该药已进入针对AD患者的II期临床试验。这些进展凸显了RIPK1作为AD治疗的一个有前景的靶点。

传统草药为中枢神经系统疾病提供了丰富但尚未被充分利用的生物活性化合物资源。在东亚草药中，冬凌草（Rabdosia rubescens）素有治疗炎症性疾病的历史。该植物的药理作用归因于多种植物化学物质，包括二萜、三萜、生物碱、黄酮类和多糖。冬凌草乙素（Pon）是从冬凌草中分离得到的一种对映-贝壳杉烷型二萜化合物，具有广泛的药理活性，包括抗炎、神经保护和抗肿瘤作用。在糖尿病并发症模型中，Pon下调IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子，同时上调IL-4和IL-10，从而改善炎症状态。在神经元中，Pon减轻了Aβ1-42诱导的损伤，并通过激活SIRT1-PI3K/Akt通路发挥保护作用。此外，Pon在各种疾病模型中显示出抗氧化和抗凋亡活性，并能诱导肿瘤细胞周期停滞和程序性细胞死亡，突显了其多靶点药理潜力。尽管其药理特性前景广阔，但Pon在AD模型中的体内效应及其对坏死性凋亡的影响此前尚未明确。本研究表明，Pon直接靶向RIPK1，减弱小胶质细胞中RIPK1-JAK1-STAT1炎症通路，并阻断神经元中RIPK1-RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡，从而显著改善5×FAD小鼠模型的认知缺陷。这些发现不仅揭示了Pon先前未被认识的机制，并通过确定RIPK1为其直接靶点填补了天然产物药理学中的一个关键空白，而且为理解AD的潜在病理过程提供了新见解。

【结果部分】

1. 冬凌草乙素的直接分子靶点：RIPK1。

图1 冬凌草乙素抑制促炎细胞因子产生并靶向RIPK1。(A) 冬凌草乙素的化学结构，这是一种从冬凌草中分离得到的天然二萜化合物。(B–C) RT-qPCR分析显示冬凌草乙素在BV2细胞中抑制促炎细胞因子的转录。细胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）预处理30分钟，再用LZ刺激4小时。Tnf-α和Il-6的相对mRNA表达水平经Gapdh归一化后进行定量。(D–E) ELISA结果显示冬凌草乙素减少LZ诱导的细胞因子分泌。BV2细胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）预处理30分钟，再用LZ刺激8小时。测定上清液中IL-6和TNF-α的水平。(F) BV2细胞以每孔1.2 × 10⁴个细胞接种于96孔板，培养18小时。进行冬凌草乙素处理时，从100 μM开始进行系列稀释，直至1.56 μM（共8个浓度）。处理8小时后，使用CCK-8法评估细胞活力。测得冬凌草乙素的CC50为59.360 ± 3.58 μM。(G) BLI分析显示冬凌草乙素与RIPK1的结合相互作用，解离常数KD为135 nM。(H) DARTS实验证明冬凌草乙素增强了HT22细胞中RIPK1对蛋白水解降解的抵抗能力。细胞接种于10 cm培养皿，培养18小时后进行DARTS实验。

2.冬凌草乙素经由RIPK1–JAK1–STAT1轴缓解小胶质细胞神经炎症。

图2 冬凌草乙素通过抑制RIPK1–JAK1–STAT1信号轴减轻神经炎症。 (A-B) BV2细胞用递增浓度的冬凌草乙素处理，随后用LZ刺激8小时。通过ELISA测定IL-6和TNF-α水平，计算抑制率并确定半抑制浓度。(C–K) 冬凌草乙素（5 μM）与Nec-1（10 μM）抑制BV2细胞中LZ诱导的RIPK1、JAK1和STAT1磷酸化。细胞经冬凌草乙素或Nec-1处理30分钟后，用LZ刺激4小时。通过蛋白质印迹分析蛋白水平，以Actin作为内参蛋白。

3.冬凌草乙素通过抑制RIPK1–RIPK3–MLKL级联反应阻断神经元坏死性凋亡。

图3 冬凌草乙素通过阻断RIPK1–RIPK3–MLKL信号通路抑制神经元坏死性凋亡。(A) BV2细胞以每孔1.2 × 10⁴个细胞接种于96孔板，培养18小时。使用冬凌草乙素处理时，从100 μM开始进行倍比系列稀释至1.56 μM（共8个浓度）。处理8小时后，采用CCK-8法检测细胞活力，测得其CC50为29.50 ± 0.204 μM。(B) 在经冬凌草乙素（5 μM）预处理30分钟、随后用TZ刺激的HT22神经元中进行LDH释放的时序测定。(C) 对Hoechst（蓝色，细胞核染色）和PI（红色，死细胞标记物）染色的HT22细胞进行高内涵成像分析。HT22神经元经冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）预处理30分钟后，用TZ刺激8小时。“Merge”图像为Hoechst与PI染色的叠加。(D) 各组细胞死亡百分比的定量分析。(E) 流式细胞术分析经冬凌草乙素或Nec-1预处理30分钟、随后用TZ刺激8小时的HT22神经元的坏死性凋亡情况。坏死细胞在Q2象限进行定量。(F) 流式细胞术Q2象限的定量分析。(G-M) 冬凌草乙素和Nec-1抑制RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。细胞经冬凌草乙素或Nec-1处理30分钟后，用TZ刺激4小时。

4.冬凌草乙素通过抑制RIPK1缓解炎症微环境诱导的神经元坏死性凋亡。

图4 冬凌草乙素抑制小胶质细胞诱导的HT22神经元坏死性凋亡。(A) 采用高内涵成像分析HT22细胞经BV2细胞上清液刺激8小时后的情况（实验方法详见第2.4节）。HT22细胞经Hoechst（蓝色，细胞核染色）与PI（红色，死细胞标记物）染色，“Merge”图像显示Hoechst与PI染色的叠加。(B) 各组细胞死亡百分比的定量分析。(C) LDH检测表明，冬凌草乙素与Nec-1均能显著降低BV2-LZ-su诱导的神经元细胞毒性。(D) 将TNF-α抗体与HT22神经元预孵育后，再用BV2-LZ-su处理。活细胞比例分析显示，TNF-α是HT22细胞中坏死性凋亡的主要介导因子。(E-K) 蛋白质印迹分析表明，冬凌草乙素或Nec-1处理能减弱BV2-LZ-su刺激的HT22细胞中RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。

5.冬凌草乙素通过抑制神经炎症与坏死性凋亡改善5×FAD小鼠的认知缺陷。

图5 冬凌草乙素改善5×FAD转基因小鼠的认知功能。 (A) T迷宫实验示意图。(B–D) T迷宫实验结果显示，与未处理的5×FAD小鼠相比，经冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）处理的5×FAD小鼠在探索新臂时行进距离更长、进入新臂次数更多、探索新臂的潜伏期更短。(E) Y迷宫实验示意图。(F–H) Y迷宫实验数据表明，与未处理的5×FAD小鼠相比，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）处理使5×FAD小鼠探索新臂的行进距离更长、进入新臂次数更多、探索新臂的潜伏期更短。

图6 冬凌草乙素改善5×FAD转基因小鼠的空间学习与记忆能力。(A) 巴恩斯迷宫实验示意图。(B–D) 巴恩斯迷宫结果显示，与未处理的5×FAD小鼠相比，经冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）处理的5×FAD小鼠表现出更短的目标区潜伏期、更少的目标区错误次数以及更低的目标区偏离度。(E) 探索试验期间的代表性游泳轨迹。(F) 第5天的莫里斯水迷宫探索试验显示，与未处理的5×FAD小鼠相比，经冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）处理的5×FAD小鼠在平台区域停留时间更长。

图7 冬凌草乙素治疗减少5×FAD小鼠的Aβ斑块沉积并减轻神经炎症与坏死性凋亡。(A–L) 脑组织蛋白质印迹分析显示，冬凌草乙素治疗降低了APP的表达，减少了JAK1-STAT1通路标记物（pJAK1与pSTAT1）以及促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平。同时，冬凌草乙素通过降低RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化缓解了坏死性凋亡。以Actin作为内参蛋白。(M) 免疫组织化学分析表明，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）有效减少了5×FAD小鼠海马和皮层中的Aβ斑块沉积。

6. 冬凌草乙素双重保护机制示意图。

图8 冬凌草乙素双重保护机制示意图。在阿尔茨海默病小鼠模型中，冬凌草乙素通过抑制RIPK1–JAK1–STAT1信号轴，减少小胶质细胞分泌TNF-α等神经炎症因子，从而缓解神经炎症；同时，冬凌草乙素阻断RIPK1–RIPK3–MLKL信号级联反应，抑制神经元坏死性凋亡。

【结论与讨论】

冬凌草乙素通过靶向RIPK1，对AD中两个关键的病理过程—神经炎症和坏死性凋亡—产生双重神经保护作用。这些发现凸显了冬凌草乙素作为AD疾病修饰疗法的潜力，并为天然产物来源的RIPK1抑制剂在神经退行性疾病中的临床开发提供了基础。

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