聚丙烯酰胺凝胶电泳技术等方法检测蛋白纯度

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

Part.1.技术原理流程

SDS-PAGE以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，在SDS存在下使蛋白质变性并均匀带负电，从而在电场中按分子量大小迁移。实验主要包括制胶、上样、电泳、染色与脱色等步骤。通过比对蛋白Marker或标准曲线，可判断目标蛋白分子量，并通过条带单一性评估纯度。

Part.2.案例分享

微源检测采用SDS-PAGE与2-DE对人血白蛋白及重组人白蛋白进行纯度分析。结果显示，SDS-PAGE图谱中两种样品主带相似，但重组样品中可见宿主蛋白杂带（图1、图2）。通过胶体考染结合图像分析软件（Labworks45）计算，人血白蛋白纯度为94.41%，略低于醋酸纤维素薄膜电泳结果（97.0%），说明SDS-PAGE具有更高灵敏度，能检出更多微量杂质。

图1.胶体考染SDS-PAGE图谱 1:蛋白相对分子质量maker;2:人血白蛋白;3:重组人白蛋白

图2.银染SDS-PAGE图谱 1:蛋白相对分子质量maker;2:人血白蛋白;3:重组人白蛋白

进一步采用2-DE结合银染技术（图3），发现重组白蛋白中仍残留宿主细胞蛋白斑点，提示需进一步纯化以提高产品安全性。该研究体现了SDS-PAGE与2-DE在蛋白纯度分析中的互补优势：SDS-PAGE适于快速筛查与分子量评估，2-DE则能从等电点与分子量两个维度提供更全面的杂质谱信息。

图3.人血白蛋白与重组白蛋白2-DE图谱比较

Part.3.技术优势与局限

优势：成本低、操作相对简单，适合大多数实验室；可同时分析多个样品，提供直观的条带图谱；结合图像分析软件可实现半定量纯度评估。

局限：染色方法影响灵敏度与线性范围（如银染灵敏度高但重复性差）；背景扣除方式对灰度分析结果影响显著；无法区分分子量相近的蛋白质或修饰变体。

质量平衡法等方法应用前景

1.质量平衡法

质量平衡法通过综合测定样品中主成分、水分、灰分及挥发性有机物的含量，计算得到纯度值。该方法考察因素全面，适用于高纯度标准物质的定值。

案例：采用HPLC-SEC面积归一化法测定牛血清白蛋白（BSA）主成分（纯度＞99.6%），结合热重分析测水分、灼烧法测灰分、顶空-GC/MS测挥发物，最终得到BSA纯度为0.962g/g（图4-6）。该方法结果可靠，但依赖各组分测定精度，且对痕量结构类似物不敏感。

图4.BSA色谱图（SEC）

图5.BSA在DMSO溶液的气相色谱-质谱分析结果

图6.BSA水溶液的气相色谱-质谱分析结果

2.同位素稀释质谱法（IDMS）

IDMS通过添加同位素标记内标，结合质谱检测，实现对目标蛋白的绝对定量。该方法具有高精度、高灵敏度与抗基质干扰能力强的特点。在上一个案例研究中采用IDMS基于苯丙氨酸比例因子（RPhe）测定BSA纯度。通过水解BSA、添加标记苯丙氨酸、LC-MS/MS分析。典型步骤如下：

将样品一次性转入离心管中，用新配制的0.1% 甲酸水溶液将其配制成1mg/mL的溶液。取200 μL稀释的BSA溶液，真空干燥后加入6mol/L的盐酸，通氮除氧后密封，在（110.0±0.5）℃的烘箱中水解48h。水解后加入苯丙氨酸同位素标记物并混匀溶液。氮气吹干后用含有0.1%甲酸的水溶液复溶，进样分析，计算得纯度。结果与质量平衡法结果高度一致，验证了方法的准确性。

随着蛋白质药物与生物标志物研究的深入，对纯度分析的精度与可靠性要求日益提高。质量平衡法与IDMS凭借其高准确度与可溯源性，在标准物质研制、生物药品质控及临床诊断标准化中展现出重要价值。尤其是IDMS技术，结合靶向蛋白质组学策略，有望成为复杂生物样品中蛋白质绝对定量的金标准。

微源检测实验室在生物药研发阶段为重组蛋白、单抗、双抗等生物药生产工艺优化提供蛋白纯度检测服务，帮助客户确定最佳的纯化条件，提高蛋白产量和质量。针对生物合成工艺中的宿主蛋白残留、酶残留等问题，提供专业的检测方法开发和定量分析服务，帮助客户评估工艺残留杂质对产品质量和安全性的影响。实验室严格遵循国际国内法规要求，确保检测的准确性和可靠性。