调控pH，发了一篇Nature Chemistry！

在细胞内，pH是影响蛋白质功能、化学反应速率及细胞活力的关键环境因子。传统上，细胞依赖膜结合细胞器（如溶酶体、线粒体）并通过主动运输消耗能量来建立与维持pH梯度。然而，近年研究发现，生物分子可通过相分离形成高浓度的凝聚体，这些无膜结构是否以及如何调节局部pH，成为一个重要的科学问题。理解这一机制对于认识细胞组织原理及病理过程具有重要意义。

剑桥大学Tuomas P. J. Knowles课题组首次揭示生物分子凝聚体可在平衡状态下维持显著的pH梯度，且无需外部能量输入。通过微流控平台在微米尺度上研究单个凝聚体，团队发现凝聚体倾向于使其内部pH趋近于分子净电荷为零的条件（等电点附近），从而最小化静电排斥。该研究证明蛋白质凝聚体能够驱动形成酸性或碱性微环境，且其pH可通过组成调控，甚至可构建具有多重pH区域的空间复杂结构。这一发现提示，生物分子凝聚可能普遍产生丰富且可调控的电化学微环境，从而在生命体系中调节生化反应活性。相关论文以“Biomolecular condensates sustain pH gradients at equilibrium through charge neutralization”为题，发表在Nature Chemistry上。

为量化pH对生物分子相行为的影响，研究团队采用组合微流控液滴平台，高通量生成具有连续pH梯度的微滴，并绘制了胰岛素类似物——胰岛素甘精的pH响应相图（图1）。结果显示，相分离仅发生在接近其等电点（pI≈6.8）的狭窄pH范围内，此时分子净电荷接近零，有利于分子间相互吸引而发生凝聚。通过对稀相浓度等值线的分析，研究者发现无论起始环境为酸性还是碱性，凝聚体内部的pH总是向该蛋白质的等电点方向偏移，即质子被排斥或吸入凝聚体，以最小化其内部的静电排斥能。这一现象随后被比率式pH荧光染料SNARF-4F的共聚焦成像直接证实：稀相pH随环境变化，而凝聚体内部pH则稳定在6.5-7.0之间。研究进一步发现，增加盐浓度（如KCl）可通过电荷屏蔽效应拓宽相分离发生的pH范围，表明静电排斥是调控相行为的关键因素。

图1 | 解析pH响应性大分子相行为。 a，填充有色溶液以突显装置特征的微流控芯片图像，用于生成连续的pH相图。b，用于生成连续pH相边界的芯片设计及流动剖面示意图。c，胰岛素变体肽（胰岛素甘精）的pH响应相边界，与分子净电荷（Q）相关。数据被网格化以评估局部分离条件的比例（Fps = 1，红色；Fps = 0.5，白色；Fps = 0，蓝色），通过平均确定（n总计 = 75,021）。数据代表一次独立重复，采样效应和重复再现性已在扩展数据图2中进一步测试。d, e，在低pH (d) 和高pH (e) 相边界处稀相等值线梯度 (K) 的可视化。稀相等值线通过为每个微滴中获得的稀相浓度进行切片而生成的相分离点的红色阴影显示。下图：示意图表示从减小的结线梯度推断出的质子分配。

为了验证电荷中和驱动pH梯度这一原理的普适性，研究者转向其他蛋白系统。对于酸性蛋白PGL3（pI≈5.1），其凝聚体内部pH会向酸性方向偏移，形成相对于环境更酸性的微环境（图2）。相反，对于碱性蛋白FUS（pI≈9.4），其凝聚体内部则呈现碱性pH。这种趋向于各自等电点的pH调节，在不同触发条件（如改变离子强度或加入PEG）下均稳定存在，说明是凝聚体形成的固有特性。通过分析蛋白质序列电荷密度平方（q²，作为静电排斥能的表征）随pH的变化，发现其最小值均位于蛋白的等电点附近，从能量角度证实了pH梯度有助于降低凝聚体内的静电排斥。

图2 | 多相、多pH凝聚体。 a, PGL3在低离子强度下形成凝聚体时，稠密相和稀相pH的比率式染料读数。b, 在固定PGL3浓度下，添加KCl或PEG触发相分离时，稠密相pH的分布。c, 在固定盐和PEG条件下，不同总蛋白浓度时PGL3稠密相pH的分布。d, PGL3净电荷密度及其平方随pH的变化，最小值接近等电点如箭头所示。e, 在不同KCl浓度下形成的PGL3凝聚体的稠密相和稀相pH。f, 在不同PEG浓度下形成的PGL3凝聚体的稠密相和稀相pH。g, FUS蛋白的净电荷密度及净电荷密度平方随pH的变化，最小值接近等电点如箭头所示。h, 在稠密相和稀相中，两个发射通道的空间分辨比率式染料信号、发射强度比及对应pH，针对在10% (w/v) PEG, 2.5 µM蛋白, 150 mM KCl和50 mM TRIS (pH=7.3) 缓冲条件下形成的FUS凝聚体。比例尺，2 µm。i, 在相同条件下FUS稠密相和稀相pH。j, NCL蛋白及其∆D/E缺失突变体（缺失富含酸性氨基酸的区域）的净电荷密度及净电荷密度平方比较。箭头指示基于等电点的最小值差异。k, 在pH=7.2时，有/无D/E区域的NCL净电荷密度平方比较（左）。参考文献25中观察到的体外pH梯度，针对由15 µM NCL蛋白, 1 µM pre-rRNA和0.2 µM Lyar蛋白形成的凝聚体。l, 驱动pH梯度的蛋白稠密相缓冲作用机理示意图。

研究进一步探讨了异型分子相互作用对pH梯度的影响。当带正电的FUS与带负电的RNA共同相分离时，形成的凝聚体内部pH呈中性，不再呈现FUS同型凝聚时的碱性梯度（图3）。这是因为FUS与RNA通过静电吸引形成复合物，其整体净电荷在pH 7附近趋近于零，无需额外的pH偏移来降低排斥。这表明异型相互作用可以重新设定凝聚体的有效等电点。此外，通过向PGL3凝聚体中添加带不同电荷的多聚氨基酸“客体分子”（如多聚赖氨酸pK或多聚谷氨酸pE），可以精确地调节甚至逆转凝聚体内部的pH（图3），展现了通过组成工程调控微环境化学性质的潜力。

图3 | 通过组成工程动态调控凝聚体pH。 a, 在不同KCl和PEG浓度下PGL3稠密相和稀相pH。b, 在不同p(A)-RNA浓度下FUS-RNA共凝聚体pH。c, FUS及其与p(A)-RNA混合物随pH的净电荷变化。d, 向PGL3凝聚体添加多聚赖氨酸(pK)及观察到的稠密相pH值。e, f, pK添加对PGL3凝聚体pH及相分离的影响。g, h, 向PGL3凝聚体同时添加pE和pK对pH的调控。

更引人注目的是，研究展示了如何构建具有多相结构、且各相具备不同pH的复杂凝聚体（图4）。当PGL3、RNA与带正电的多聚赖氨酸（pK）混合时，会形成相分离的凝聚体，其中富含pK的区域呈弱碱性，而富含PGL3的区域呈弱酸性。这是由于pK与RNA的结合亲和力远高于PGL3，导致两者竞争性结合RNA并发生相分离，形成电化学性质迥异的亚区室。这证明单个凝聚体内部可以同时维持多个不同的pH微环境。

图4 | PGL3与p(A)-RNA和多聚赖氨酸(pK)的多相、多pH凝聚。 a, PGL3、pK和p(A)-RNA凝聚体的共聚焦图像。b, 跨多相凝聚体亚结构的荧光强度剖面，显示不同的pK富集和PGL3富集区域。c, PGL3和FITC标记pK的RNA结合曲线。d, 不同pK浓度下PGL3-pK-RNA凝聚体的SNARF-4F pH成像。比例尺，5 µm。e, 来自d的一个多相凝聚体的空间分辨pH图，突出碱性(pK富集)和酸性(PGL3富集)区域。f, 不同多相亚结构中局部pH值的定量比较。g, 示意图说明PGL3和pK之间对RNA的竞争性结合，驱动了在平衡状态下形成具有独特电化学微环境的分离稠密相。

研究者将目光从单一蛋白扩展至复杂的细胞内凝聚系统。对蛋白质组数据库的分析发现，人类蛋白质组的等电点分布呈现明显的双峰模式，酸性（pI低）和碱性（pI高）蛋白占主导，中性电荷蛋白稀少（图5）。这种电荷偏倚在易于发生相分离的蛋白子集中依然存在，提示静电多样性是生物分子凝聚的普遍特征。通过对已知的核仁等无膜细胞器进行蛋白质组学分析，并结合RNA的贡献进行电化学建模，计算得到的凝聚体混合物等电点与细胞内实测的pH梯度高度吻合（图5）。这证明，仅从组成序列即可相当准确地预测复杂凝聚体的电化学性质。

图5 | 通用蛋白质电荷偏倚转化为细胞内凝聚体pH梯度及人类凝聚体巨大的电化学多样性。 a, 高相分离倾向蛋白质（使用DeePhase评分>0.8）的pI分布。b, 从细胞裂解液NPM1凝聚实验获得的定量蛋白质组学数据的pI分布（上），以及完整蛋白质集合随pH的净电荷变化与平均值的比较（下）。c, 从PhaSepDB获得的复杂凝聚体蛋白质组随pH的净电荷变化可视化。d, 通过评估PhaSepDB蛋白质序列获得的复杂凝聚体蛋白质组混合物pI比较。e, 核仁和核斑的净电荷密度平方谱图与观测到的体内pH梯度关联。f, 用于评估复杂凝聚体电化学性质理论范围的“蛋白质凝聚体图谱”示意图。g, 从蛋白质凝聚体图谱所有85个条目获得的凝聚体簇pI直方图。h, 蛋白质凝聚体图谱的净电荷密度平方比较。

最后，研究者构建了一个最小化的理论模型（图6），将聚合物视为可带正、负或中性电荷的实体，并纳入促进相分离的吸引相互作用与带电态间的静电排斥。模型分析证实，相分离最可能发生在系统净电荷最小化的条件附近。更强的静电排斥会使得相分离只能发生在更接近等电点的狭窄pH范围内。该模型从理论上支持了观察到的现象：凝聚体作为一个空间分隔的缓冲系统，通过其内部高浓度的可电离基团，在平衡状态下形成并维持pH梯度。

图6 | 生物分子相分离作为产生独特pH微环境的机制。 a, 计算通用聚合物pH依赖性相行为的理论模型设置。b, 通过求解理论模型并改变等电点、吸引弗洛里参数和排斥静电参数等关键参数，预测组成依赖的旋节线位置。c, 示意图总结：为最小化静电排斥，生物分子凝聚体在平衡状态下维持独特的pH微环境，无需膜包裹或主动过程。

这项研究系统揭示了生物分子凝聚体作为“空间区室化缓冲器”的普遍能力，它们通过调节内部pH至等电点来最小化静电排斥，从而在无膜、无能量消耗的条件下建立稳定的pH微环境。这种机制为理解细胞内复杂的区室化调控、酶活性的局部调节以及生命起源早期如何建立化学梯度提供了全新视角。未来，通过设计具有特定电荷性质的生物大分子，有望人工构建具有定制电化学微环境的凝聚体，从而在合成生物学、材料科学及药物递送等领域开辟新的应用途径。