高速钙成像

图1：表达谷氨酸探针SF-iGluSnFR的海马神经元培养物轴突树突，使用Kinetix sCMOS相机拍摄。

背景

基里尔·沃尔林斯基(Kirill Volynski)教授领导的沃尔林斯基实验室，主要致力于研究神经递质释放的调控机制，这是大脑中神经元之间通讯的基础。

正如沃尔林斯基教授所解释的：“神经元之间的突触是健康和疾病中调制和可塑性的关键位点。因此，详细了解在单个突触水平上调控突触传递的细胞机制，是理解复杂神经元回路运作的先决条件。”

“我们最近开发了新的成像方法，首次使我们能够研究Ca2+内流与囊泡胞吐之间的关系，并探测单个小型突触前末梢的离子通道功能。这些方法基于使用荧光显微镜来成像Ca2+离子浓度和囊泡释放速率的快速变化;以及使用超分辨率扫描离子电导显微镜对小突触前末梢进行膜片钳记录。”

“利用这些方法，我们研究介导Ca2+内流进入末梢的不同通道如何控制囊泡的释放，它们如何影响突触可塑性，以及突触如何受到其他作用于突触前末梢的调制性神经递质的影响。”

挑战

高速Ca²⁺成像需要兼具高灵敏度与高速度。此前，Volynski教授的实验室使用Prime 95B 25mm相机，在最大化灵敏度和视野的同时实现了高速采集。该相机在速度、视野(FOV)和稳定性方面相比早期的EMCCD方案均有显著提升。然而，其速度仍是一个限制因素，既难以跟上样品中的高速动态变化，也受限于光采集过程——因为必须使用“伪全局快门”触发器来控制光源。

在Prime 95B这类卷帘快门相机中，一帧图像的采集从传感器顶部开始，并极快地向下扫描到底部。尽管传感器顶部和底部之间的时间差非常微小，但它仍可能为高度精密的高速实验引入畸变。因此，必须使用“伪全局快门”来一次性捕获整个传感器。其工作原理是：通过高级硬件触发，仅在相机传感器所有行都处于采集状态时才开始一帧图像的采集，然后在下一帧之前保持非激活状态。图2中的时序图概述了这一概念。

图2：滚动快门相机的工作时序，以及通过光源触发实现全局曝光。

相机在开始曝光前必须等待的时间被称为“死区时间”或“帧时间”，它直接由相机的帧率决定。相机速度越快，能够获取的全局数据就越多。

Kinetix相机具有低噪声和高速读出特性，这使我们能够在更高帧率下成像的同时捕获更多光子。——基里尔·沃林斯基教授

解决方案

Kinetix是一款革命性的sCMOS相机，其量子效率与Prime 95B一样接近完美的95%，同时凭借其“灵敏度”模式下更低的读出噪声，能够更准确地测量信号。此外，它在帧率和传感器尺寸方面均有提升。Kinetix是一款1000万像素的相机，拥有巨大的29.4毫米对角线传感器——在其“灵敏度”模式下，整个视场可以以每秒88帧的速度读出;而Kinetix还具备“速度”模式，在该模式下，整个1000万像素传感器可以惊人的每秒500帧的速度读出。

Kinetix的“灵敏度”和“速度”模式将为伪全局快门成像带来哪些改进?

灵敏度模式：更长的曝光时间

对Volynski教授来说，延长有效曝光时间(即“帧时间”加上“触发开启”时间)至关重要。Kinetix的帧时间比Prime 95B快得多，那么，如果我们比较Kinetix在灵敏度模式下与Prime 95B的相似200行感兴趣区域(ROI)，这是否会导致更长的有效曝光时间?

在200行ROI下，两台相机的速度均为300fps，即每帧3.3毫秒。区别在于帧时间：Prime 95B为2.08毫秒，留给光源开启和光子收集的时间为1.25毫秒;而Kinetix在灵敏度模式下为0.71毫秒，留给光源开启的时间为2.6毫秒，是Prime 95B的两倍多。因此，在相同帧率下，Kinetix更短的帧时间实现了更长的有效曝光，如图3所示。

图3：Prime 95B与Kinetix(灵敏度模式)的伪全局快门时序示意图。两台相机在200行ROI下均以300fps运行。由于Kinetix的帧时间更短，其“灵敏度”模式能实现显著更长的“触发开启”时间，从而收集更多光子。

速度模式：更长的曝光时间与更高速度

除了更长的有效曝光时间，Volynski教授还追求高速度以捕捉动态钙活动。这正是Kinetix速度模式的用武之地，它能以500帧/秒的全传感器速度运行，从而捕捉超快速特征。

以前述相同示例为例，当Kinetix处于速度模式时，其帧时间极短(0.13毫秒)，因此有足够时间完成200行扫描，最终实现600帧/秒的整体帧率。即使采集速度提升了一倍，其触发时间仍比Prime 95B的1.54毫秒长20%，从而实现了更高的速度与更长的照明时间，如图4所示。

图4：Prime 95B与Kinetix(速度模式)的伪全局快门时序图。目标与之前相同，均为300帧/秒和200行感兴趣区域。在速度模式下，Kinetix的帧时间快得多，因此能在相同时间内采集到两倍的帧数，同时还能保持每帧多20%的“触发开启”时间用于光线收集。

Kinetix是一款突破性的相机，将速度与灵敏度完美结合，在大尺寸传感器上实现了超高速与超低噪声。它不仅性能强大，还具备极高的灵活性，可通过先进的硬件触发和读出模式(如伪全局快门)对读出进行精细控制。

与上一代CMOS相机相比，Kinetix的速度提升，在其“灵敏度”模式下，可为伪全局快门应用带来有效曝光时间的显著增加，从而收集更多光线。而其“速度”模式拥有极快的帧时间，既能提升速度，又能增加有效曝光时间。

此外，Kinetix的传感器宽度更大，还能提供比前代产品宽18%的水平视场。