基于ELISA原理的宿主细胞蛋白（HCP）检测方法验证的核心要素

一个总被监管追问、临床到上市都绕不开的关键指标——抗体覆盖率，成为决定HCP检测准不准、稳不稳的“裁判”。

一、为什么抗体覆盖率是HCP检测的“必做项”？

为了更好地控制工艺和产品质量的稳定，各国监管机构均要求提供使用的HCP ELISA试剂盒的抗体覆盖率数据。一般需进行覆盖率分析的场景一般有以下几种情况：

• 临床II期后，若是继续使用商品化试剂盒，则需要评估试剂盒抗体覆盖率是否可以继续用于质量监控；
• 临床III期及以后阶段，产品研究者开发了平台化或工艺专属型的HCP监测方法，该类试剂盒在使用前要评估覆盖率水平与商业化覆盖水平的差异；
• 申报时没有提交覆盖率数据，监管机构可能会对企业提出发补的要求；
• 产品上市后发生了包括生产场地变更，工艺变更，HCP分析方法变更等因素的变更，研究者则需要评估变更前后抗体覆盖率水平的差异，以及该差异对药品质量与安全带来的影响[1]。

一般推荐在临床II期末进行抗体覆盖率表征，此时一般生产工艺已经固定并且有相对充足的研究时间[2,3]。

二、抗体覆盖率怎么测？传统方法vs创新技术大对比

关于抗体覆盖率评估法规中一般推荐的方法有两大类：一类是传统2D-WB法，另一类是基于抗体亲和的免疫捕获类方法。

传统2D-WB法存在需要蛋白变性，样品经过前处理会破坏蛋白天然表位；转膜效率低；易产生非特异性，难以代表真实的覆盖率水平等方法缺陷。

图1 2D-WB进行抗体覆盖率验证的流程

湖州申科自主开发了免疫磁珠捕获分离技术[4]（immunomagnetic beads separation，IMBS)，利用免疫磁珠的半液态性质，可以在悬浮的条件下与HCP样本充分混匀结合，整个过程蛋白无需变性，结合方式与ELISA检测条件相似，可以获得更真实的覆盖率结果。

IMBS整体的技术流程如图2所示，首先将HCP多克隆抗体偶联到磁珠上，偶联抗体的磁珠与样品HCP共孵育，洗涤未结合的HCP，洗脱收集磁珠上偶联抗体结合的HCP，将未经免疫磁珠的处理HCP样品与经IMBS亲和吸附获得的HCP分别用2D或MS进行抗体覆盖率分析。

图2 IMBS进行覆盖率评估技术流程图

HCP抗体覆盖率评估实验操作复杂，需要在建立实验方法阶段对关键步骤进行充分的验证，以证明实验方法的稳健性。湖州申科开发的基于磁珠捕获的IMBS方法，在开发过程中对关键步骤进行了充分验证,相关结果经过专业评审，验证的内容如下（部分）：

• 方法优化：针对磁珠与抗体的偶联比例、洗涤液体积、洗涤次数、洗脱次数等关键参数进行优化验证，以保证方法的稳健性；
• 过程质控：二维电泳存在实验步骤多，时间跨度长，中间步骤难以控制等缺陷，因此在等电聚焦实验部分设计了荧光标记多肽，可快速判断等电聚焦效果。在SDS-PAGE电泳的两侧增加40ng银染质控，用于胶后期的银染显色的控制；
• 方法重复性：针对2D分析以及LC-MS分析我们都进行了重复性确认，其中2D分析方法重复性可达到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上。
• 上样量优化：针对2D分析以及LC-MS分析我们进行了上样量确认，消除上样量差异对检测结果带来的影响；
• 假阳性：排除样品与阴性抗体之间是否存在非特异性结合，确定IMBS实验所设定的步骤、参数是否有假阳性结果存在。

*以上验证内容原文已发表于《中国新药杂志》[5]。

三、IMBS®技术平台案例展示

我们使用两种方法对CHO多克隆抗体进行了抗体覆盖率分析。如图3A图所示，IMBS-LC-MS法可以检测到2400多个蛋白，验证CHO-HCP抗体覆盖率为86.8%；我们使用IMBS-2D方法进行抗体覆盖率分析，图3B图所示，可以检测到1100多个蛋白点数，覆盖率结果在71.0％。

图3 分别使用IMBS-LC-MS（A图）和IMBS-2D方法（B图）对CHO多克隆抗体进行了抗体覆盖率分析

2023-2024年近一年时间内，湖州申科通过合规的质量体系，验证的覆盖率分析平台，已承接抗体覆盖率服务50+案例，助力各类生物制品申报，具体内容如下表所示：

参考文献

[1] 邱晓,项金忠,赵靖,等.《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则(试行)》解读[J].中国食品药品监管, 2023(2):28-35.

[2] Wang X , Hunter A K , Mozier N M .Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment[J].Biotechnology and Bioengineering, 2009.

[3] 国家药典委员会. 生物样本定量分析方法验证指导原则. 《中华人民共和国药典》2020年版 四部 通则 9012. 北京: 中国医药科技出版社, 2020.

[4] USP. (2022). <<1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals >. United States Pharmacopeia. 第45版. Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention.

[5] 豆敏华，陈秋燕，张宏声等，磁珠免疫捕获技术IMBS运用于宿主细胞蛋白抗体覆盖率分析，中国新药杂志（2024）