NAR丨张晓辉团队开发出多碱基随机饱和突变的碱基编辑器：ACG-BEs

碱基编辑器，主要包括单碱基和双碱基编辑器，能够在编辑窗口内诱导碱基转换或颠换，从而产生一定程度的 DNA 序列多样性，这使其在基因筛选、定向进化和谱系追踪等方向具有重要潜力【1】。目前，碱基编辑技术已通过在基因组特定位点引入多样化突变，加速了基因功能筛选研究，并取得显著进展【2】。多项研究将 ABE 或 CBE 与 sgRNA 文库结合，建立了高通量筛选平台，用于 DNA 损伤反应的功能点突变筛选【3】、癌症中干扰素-γ信号通路研究【4】、人原代T细胞抗肿瘤效应解析【5】、以及胎儿血红蛋白表达调控模式的研究【6】。因此，碱基编辑器在诱导 DNA 序列多样性方面具有广阔应用前景。然而，目前的碱基编辑器受限于碱基底物种类不足（最多为腺嘌呤和胞嘧啶），以及只能产生特定单碱基突变而非饱和突变，导致诱导产生 DNA 多样性仍非常有限，这限制其在因DNA序列多样化的进行筛选方面的应用潜力。

2025年1月14日，中国医学科学院系统医学研究院/苏州系统医学研究所张晓辉团队在Nucleic Acids Research在线发表了题为

Triple base editor catalyzes saturation mutation of adenine, cytidine and guanin

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研究团队通过功能蛋白融合策略， 将具有高A/C催化活性的腺嘌呤碱基编辑器、进化的N-甲基嘌呤DNA糖苷酶 、和CRISPR/Cas9进行融合，从而实现了高效地对腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）进行多重饱和突变，成功开发出新型多碱基编辑工具ACG-BEs。这一工具能够高效催化三种碱基底物（A、C或G），实现多达9种碱基转换或颠换（A→G/C/T、C→T/G/A和G→C/T/A）。

图1- ACG-BEs结构、工作原理以及编辑效率

研究人员发现，ACG-Bes可在在HEK293T细胞中成功对A、C或G三种碱基产生了编辑，其中A到G/C/T的转换效率达80.5%，C到T/G/A的转换效率达75.8%，G到C/T/A的转换效率达63.4%。除此之外，该编辑工具对A/C的同时编辑效率最高为55.0%，A/G的同时编辑效率最高为66.5%，C/G的同时编辑效率最高为40.3%，对A/C/G 同时编辑效率最高为 31.3%。并且与相应的单碱基编辑器相比，ACG-BEs诱导的sgRNA依赖性或sgRNA非依赖性DNA脱靶事件效率相当甚至更低。

在疾病相关筛选实验中，通过ACG-BE7对HUDEP-2(ΔGγ)细胞在HBG启动子区域编辑之后，使得该域携带多种不同的A/C/G碱基替换，并赋予不同程度的γ-珠蛋白高表达。 同时，研究统计了ACG-BEs诱导的基因编码区氨基酸变化和对应的DNA密码子改变。结果表明，64种DNA密码子中有63种可被ACG-BEs靶向，产生3-63种DNA密码子改变；所有19种氨基酸以及终止密码子均可被ACG-BEs靶向，导致1-19种不同的氨基酸变化。此外，由A/C/G密码子组成的氨基酸Arg（CGA）、Gln（CAG）、Ser（AGC）、Thr（ACG）、Asp（GAC）和Ala（GCA）的三种碱基可被ACG-BEs同时编辑，产生27种DNA密码子改变和10-13种氨基酸变化。这表明ACG-BEs是一种优秀的多碱基底物编辑工具，在基因筛选、定向进化和谱系追踪等方向具有重要潜力。

综上，本研究通过融合多种不同功能的蛋白发现并筛选出了高效的多碱基编辑ACG-BEs。该编辑工具能够对A、C或G三种碱基进行随机的饱和突变，并且能够实现多种不同碱基的同时随机突变。这种针对多底物并产生非单一产物的工作特性赋予了该工具在诱导DNA序列多样性方面的强大能力，这进一步拓展了碱基编辑技术在目的基因以及特定元件功能区域筛选等方面的应用研究。

该研究由中国医学科学院系统医学研究院/苏州系统医学研究所张晓辉研究员课题组完成。张晓辉研究员为本文通讯作者。北京协和医学院系统所2022级博士研究生吴友明、2023级博士生王锦鑫、2024级博士生尚梦宇以及郑州大学2023级硕士生张子依为该论文的共同第一作者。北京协医院王晓月教授，郑州大学卢双双教授，广州医科大学冀开元教授、对本研究给予了重要支持与帮助。

原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/54/2/gkaf1423/8425338

制版人： 十一

参考文献

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[2] Lue, N.Z. and Liau, B.B. (2023) Base editor screens for in situ mutational scanning at scale.Molecular Cell, 83, 2167-2187.

[3] Hanna, R.E., Hegde, M., Fagre, C.R., DeWeirdt, P.C., Sangree, A.K., Szegletes, Z., Griffith, A., Feeley, M.N., Sanson, K.R. and Baidi, Y. (2021) Massively parallel assessment of human variants with base editor screens.Cell, 184, 1064-1080. e1020.

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[6] Cheng, L., Li, Y., Qi, Q., Xu, P., Feng, R., Palmer, L., Chen, J., Wu, R., Yee, T. and Zhang, J. (2021) Single-nucleotide-level mapping of DNA regulatory elements that control fetal hemoglobin expression.Nature genetics, 53, 869-880.

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