微生物定量接种技术——滴板法

在微生物学研究与实验室常规操作中，滴板法（Drop Plate Method）作为一种精确、高效且经济的菌液接种与定量技术，广泛应用于细菌、真菌等微生物的菌落计数、表型筛选、抗菌试验及功能分析等场景。该方法通过标准化液滴分配实现微量样本的平行接种，兼具操作简便与结果可重复的特点，已成为微生物定量实验中的重要工具。

一、滴板法的定义与原理

滴板法是一种基于微量移液系统、将一定体积的菌悬液以液滴形式点种于固体培养基表面的接种技术。其核心原理在于利用均匀分配的液滴体积（通常为 5–10 µL），实现微生物在平板表面的局部、离散生长，进而通过菌落计数或表型观察进行定量或定性分析。

与传统的涂布法或倾注法相比，滴板法具有：

• 样品用量少，尤其适用于样本量有限的情况

• 高通量潜力，单板上可同时接种数十个样本

• 操作标准化强，减少人为误差

• 适用于抑菌圈测定、表型筛选等多种实验设计

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二、标准操作流程与关键步骤

1、菌悬液制备与浓度调整

• 将待测菌株培养至适宜生长阶段（如对数生长期）

• 使用生理盐水或缓冲液调整菌液浓度，通常控制在 10⁴–10⁷ CFU/mL

• 必要时进行梯度稀释，确保菌落可计数且不重叠

2、液滴点样与分布

• 使用经校准的微量移液器或多通道移液器

• 每点接种体积通常为 5–10 µL

• 在琼脂表面均匀分布，避免液滴流动或融合

• 可配合使用模板或标记确保点样位置一致

3、液滴干燥与吸收

• 在生物安全柜中静置 10–15 分钟，使液滴被琼脂表面吸收

• 避免震动或倾斜，防止液滴扩散

4、培养与观察

• 根据微生物类型选择适宜温度与时间进行培养

• 培养后记录各点菌落形态、数量或抑菌圈直径

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三、主要应用领域

1、菌落计数与活力测定

• 适用于低浓度菌液计数，避免涂布法中菌液扩散导致的计数误差

• 常用于环境微生物、肠道菌群、发酵样品等菌落形成单位（CFU）测定

2、抗菌药物敏感性试验

• 用于测定最小抑菌浓度（MIC）或抑菌圈

• 在单一平板上可同时测试多种药物或浓度梯度

3、突变体筛选与表型分析

• 高通量筛选抗生素抗性、营养缺陷型或报告基因表达菌株

• 适用于酵母双杂交、细菌双杂交等遗传学实验

4、酶活或代谢产物检测

• 配合显色底物或指示剂，检测微生物胞外酶活性

• 应用于产酶菌株筛选、代谢途径研究等

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四、实验设计与优化要点

液滴体积一致性控制：

• 使用校准后的移液器与低吸附枪头

• 点样时枪头与琼脂表面保持轻触，避免刺入培养基

培养基表面状态：

• 琼脂厚度均匀（通常 3–4 mm）

• 表面干燥适度，过湿易导致液滴扩散，过干则影响吸收

菌液浓度与稀释度选择：

• 预实验确定合适稀释梯度

• 理想菌落数为 10–100 CFU/滴，便于准确计数

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五、滴板法优势

• 经济高效：节省培养基、试剂与样品

• 通量高：单板可容纳 20–96 个样本点

• 适用性广：适用于好氧与厌氧微生物、细菌与真菌

• 结果直观：便于菌落观察、表型比较与图像分析

滴板法以其精准、灵活、高效的特点，在基础微生物学研究与工业应用之间架起了实用的技术桥梁。掌握该方法的标准化操作与优化策略，不仅有助于提升实验数据的可靠性，也为微生物相关的高通量筛选与功能研究提供了稳定支撑。

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