单分子荧光方法揭示DNA聚合酶Ⅰ选择性的动力学机制 | 进展

DNA聚合酶是负责DNA复制、修复和重组的关键酶，其复制保真度对维持基因组稳定性和预防疾病至关重要。DNA聚合酶通过动力学校对实现高保真度，其复制错误率可低10-6，然而，受限于传统的“开放-闭合”二态模型,该机制尚未成功应用于量化聚合酶的保真度。近年来研究发现，大肠杆菌DNA聚合酶I在核苷酸结合过程中存在一个“半开”构象，可能作为新的保检查点，但其动力学路径以及对保真度的定量贡献，至今仍未明确。

近期，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心软物质物理实验室SM4组长期致力于单分子酶动力学与生物界面物理的研究，结合单分子荧光成像技术与脂质体封装技术，深入探索了DNA聚合酶I通过“开放”与“半开”构象的双重筛选，实现DNA高保真复制的分子机制，解释了DNA聚合酶I的复制错误率能低至10-6量级的根本原因，取得了以高时间分辨率长时间观测单个酶分子构象变化的突破。

研究团队通过将DNA聚合酶及其底物封装进脂质体，然后置于共聚焦显微镜观测，成功延长了基于扩散的共聚焦显微镜的观测时间，从而实现了以高时间分辨率（0.5 ms）长时间观测单个聚合酶分子的构象变化。利用这一技术，研究团队发现，聚合酶会在“开放”和“半开”两个构象识别并拒绝错误核苷酸，“开放”和“半开”构象形成两道连续的保真检查点，并且该双重选择机制对脱氧核苷酸和核糖核苷酸均具有高效的筛选能力。研究团队基于这一发现提出了DNA聚合酶对核苷酸进行两次筛选的模型，并量化了模型中的各项参数。该研究不仅加深了科学界对DNA复制高保真分子基础的理解，也为未来针对DNA复制相关疾病的药物设计和高保真酶工具的开发提供了潜在的新靶点与理论模型。

图：构建的动力学校对的反应模型（左），红色箭头表示聚合酶对核苷酸的两次筛选，以及正确和错配条件下聚合酶的自由能垒图（右）。

本研究的共同第一作者包括华南师范大学的博士研究生苑野，中国科学院物理研究所的博士研究生王浩，博士后付航，共同通讯作者为中国科学院物理研究所博士后贾棋（已出站）、李明研究员及陆颖研究员。此项研究受到了国家自然科学基金委、科技部和中国科学院等资助。研究成果已在《Journal of the American Chemical Society》杂志发表，题为“Mismatched Nucleotide Rejections at the Open and Ajar States of 2 DNA Polymerase I Ensure High Fidelity”。

编辑：辣条

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