《食品科学》：浙江工业大学关荣发教授等：益生菌胞外囊泡的分离、生物活性及应用研究进展

益生菌作为一类公认健康安全的膳食补充剂，被广泛应用于食品和临床治疗中。然而，益生菌发挥健康效益具有局限性，菌株需要经过胃酸、胆盐等消化液的考验后到达肠道，并在肠道定值超过48 h产生有益的代谢产物，且活益生菌的效果易受到饮食和生活方式的影响。2021年，国际益生菌和益生元科学协会将后生元定义为对宿主有益的灭活细菌和/或细菌成分。胞外囊泡（EVs）作为后生元的重要组成部分，其包裹的核酸、蛋白质和脂质等生物活性分子构成跨细胞通讯的核心介质，兼具生物标志物筛选和靶向治疗应用的双重潜力。

浙江工业大学食品科学与工程学院的钟浩、汤宁、关荣发*等综述益生菌EVs的概念与结构、产生机制、分离方法和生物活性，并探讨益生菌EVs在食品领域应用的潜力与挑战。

1 益生菌EVs的概念与结构

1.1 EVs的概念与分类

EVs是一种由活细胞分泌到细胞外基质且不能自我复制的纳米级脂质颗粒（40～5 000 nm），携带细胞内生物信息分子如核酸、蛋白质和脂类分子等，在细胞通讯、细胞迁移以及细胞生长等生物学过程发挥重要调节作用。古细菌、真菌、寄生虫和细菌都可以产生EVs。根据EVs颗粒粒径大小和发生途径，可将其主要分为3 种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体。这3 种亚型的囊泡尺寸范围具有一定的重叠，它们之间的主要区别在于其生物产生途径的不同。外泌体直径为40～150 nm，是由细胞内多泡体和细胞膜融合后释放到胞外基质的带负电荷的脂质颗粒，广泛存在于细胞培养上清液及多种生物体液中，包括血液、乳汁、尿液和精液等。外泌体因其广泛存在在各种体液内，便于获取和检查，在疾病诊断和靶向治疗中展现出重要的应用潜力。微囊泡直径为50～2 000 nm，由细胞膜向外出芽形成的小囊泡，可以发挥与母细胞膜相似的生物学功能。凋亡小体直径为1～5 μm，是细胞凋亡过程中由细胞碎裂形成的泡状小体，内含细胞器、胞质和一些核碎片。

1.2益生菌EVs

多数益生菌菌株已通过国际权威机构“安全资格认定”和“一般公认安全物质”的安全性评估，并获得中国卫生健康委员会（原卫生部）可用于食品的批准。益生菌因其良好的安全性以及调节肠道菌群、增强免疫力等方面的生物活性，可广泛应用于食品和生物医药领域。值得注意的是，绝大多数益生菌属于革兰氏阳性菌，其中乳杆菌属和双歧杆菌属是最具代表性的菌属。然而，部分革兰氏阴性菌也被发现具有潜在的益生作用，其中大肠埃希氏菌Nissle 1917（

Escherichia coli

Akkermansia muciniphila

1.3益生菌EVs的结构

益生菌EVs的外围结构是纳米级的双层蛋白脂质膜，其膜内主要包裹着DNA、RNA、细胞表面受体、信号蛋白、酶和脂质等物质。不同菌株产生的EVs在结构与成分组成上存在差异，但根据组成分析结果，均可划分为3大类，即蛋白质、核酸和脂质（图1）。益生菌EVs在结构与成分组成方面的一些差异源于EVs的形成路径不同。革兰氏阴性益生菌产生的EVs称为外膜囊泡，外膜囊泡由外膜起泡形成，它们携带周质内容物和细胞质成分，由磷脂、外膜蛋白、周质蛋白、毒力因子、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或脂寡糖、肽聚糖、DNA、RNA、细胞质以及内膜蛋白组成，直径为10～300 nm。革兰氏阳性益生菌产生的EVs称为细胞质膜囊泡，细胞质膜囊泡来源于细胞质膜，成分组成与外膜囊泡相似，都含有蛋白质、脂质和核酸等物质，但不含有周质成分，直径为20～150 nm。

2 益生菌EVs的产生机制

革兰氏阴性益生菌和革兰氏阳性益生菌都能够产生EVs，这些EVs已被证明有助于多种生物过程，包括生物膜形成、毒力、生物活性物质的输出、噬菌体诱饵和基因水平转移。

2.1革兰氏阴性益生菌EVs的产生机制

革兰氏阴性益生菌EVs的产生途径主要有通过外膜起泡和爆炸性细胞裂解两种方式（图2）。外膜起泡：生物合成肽聚糖不平衡或疏水分子嵌入外膜时，会引起细胞膜失衡导致外膜囊泡化，进而分泌外膜囊泡。爆炸性细胞裂解：在噬菌体衍生的内溶素作用下，细胞壁的肽聚糖层被降解，通过细胞裂解释放的细胞内容物在自退火时被膜片段捕获成外内膜囊泡和爆炸性外膜囊泡。

2.2 革兰氏阳性益生菌EVs的产生机制

阴革兰氏阳性菌因具有较厚且坚硬的肽聚糖外层结构且缺乏外膜，最初被认为无法产生EVs。2009年，Lee等首次发现革兰氏阳性菌能够在细胞外环境自然产生EVs。此后，研究者们证实了多种革兰氏阳性益生菌（如植物乳植乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌）也能够产生EVs。革兰氏阳性益生菌EVs产生机制类似于革兰氏阴性益生菌的爆炸性细胞裂解，一些革兰氏阳性益生菌产生的自溶素或酚溶性调节素会对细胞壁的肽聚糖层产生破坏，进而形成孔洞，其细胞膜和细胞质成分从孔洞凸出到细胞外间隙并以细胞质膜囊泡的形式释放到胞外（图2）。

3 益生菌EVs的分离

益生菌EVs体积小、密度低、难以分离，且益生菌EVs的理化性质和核心蛋白质组成会因不同的培养基和分离方法而产生差异。目前，常用的技术主要包括超速离心、超滤、密度梯度离心（DGC）、沉淀、尺寸排阻色谱（SEC）等。不同分离技术有各自的优缺点，研究者需要根据样本的类型以及下游实验目的选择合适的分离方式或联用分离技术（表1）。目标益生菌EVs的鉴定需要通过多维度技术手段验证，主要包括以下3 个方面：1）形态学特征：透射电子显微镜图像显示益生菌EVs形态呈典型的球形结构，且双膜结构清晰；2）粒径分布与浓度：纳米粒子跟踪分析技术通过直接检测益生菌EVs的粒径分布（10～300 nm）及颗粒浓度（108～1011 个/mL）为量化产率提供直接依据；3）特异性标志物检测：通过蛋白质免疫印迹技术或质谱分析可定量分析益生菌EVs的生物标志物从而量化EVs，例如，外膜蛋白A家族和脂磷壁酸可分别作为益生菌EcN-EVs和嗜酸乳杆菌-EVs的特异标志物。

3.1 超速离心法和超滤法

超速离心法是目前分离益生菌EVs最常用的方法，被称为外泌体分离的金标准。超速离心法的核心原理是利用EVs和培养基中其他颗粒之间存在大小和密度的差异。益生菌EVs的分离从去除完整的细菌开始，首先使用低离心力（4 000～10 000×g）离心15～30 min去除培养基中活菌、死菌以及一些细胞碎片，然后通过0.22 μm或0.45 μm过滤器去除大颗粒和可能的污染物，最后将过滤后的上清液超速（100 000～260 000×g）离心60～90 min，得到的沉淀即为益生菌EVs。超滤是使用50～100 kDa超滤膜对预处理过的无菌上清液进行分离纯化。由于培养基中益生菌EVs的总量通常非常低，为提高EVs的浓度和纯度，研究者们常将超速离心与超滤技术组合使用。这两种方法联用有助于成功提取形态和大小均匀的益生菌EVs。然而，超滤和超速离心均存在一定的局限性，特定的过滤装置可能会影响EVs的颗粒大小和产量，部分EVs也会被截留在滤膜上。同时，高离心力也可能会破坏益生菌EVs的结构。此外，超滤和超速离心均未将益生菌EVs与其他细胞外组分（如鞭毛、菌毛、蛋白复合物或聚集体）分离。

3.2 沉淀法

沉淀是一种基于溶解度差异的分离技术，常用于从生物样品中分离蛋白质或其他大分子。EVs富含蛋白质，因此沉淀法也用于EVs的浓缩和分离。分离益生菌EVs通常采用聚合物沉淀法，在已预处理过的无菌上清液中添加终体积分数为8%～15%的聚乙二醇，4 ℃条件下孵育过夜，聚乙二醇能够降低EVs的溶解度，并通过疏水作用与囊膜表面分子结合，促使EVs聚集形成沉淀，随后低速离心即可得到EVs。Sawant等比较了超速离心法和沉淀法在分离嗜酸乳杆菌-EVs和EcN-EVs的差异，超速离心法得到的益生菌EVs产率约为沉淀法的1.5 倍，且EcNEVs的产率显著高于嗜酸乳杆菌-EVs。此外，与超速离心相比，沉淀法的关键难点是制备适当浓度和饱和度的盐溶液或聚合物溶液。尽管，基于沉淀法的市售EVs分离试剂盒价格低廉、处理时间短，但目前只能用于分离革兰氏阴性益生菌-EVs。

3.3 DGC法

DGC法被用作去除污染性蛋白质聚集体和非细菌EVs结构的额外纯化步骤。该方法的分离机制基于：在特定的离心力下，不同密度的样品组分将迁移至与其浮力密度相匹配的梯度区域，从而实现EVs与其他非囊泡组分的高效分离。DGC法分离益生菌EVs最常用的梯度液是Optiprep分离液（主要成分是碘克沙醇），在超速离心管中制备OptiPrep密度梯度（底部2 mL 45% OptiPrep，依次分层2 mL 40%、35%、30%、25%和20% OptiPrep），然后将样品沉积在线性OptiPrep梯度的顶部，并结合超速离心分离，分离的益生菌EVs在其特征密度区（1.08～1.11 g/mL）很容易通过馏分收集回收。DGC法能够产生更高质量和纯度的益生菌EVs。Hong等比较了单独超速离心分离EcN-EVs和超速离心联合DGC分离EcN-EVs的蛋白质含量，研究发现相较于超速离心法，DGC法的蛋白回收率明显下降。另一方面，在限制铁的培养基条件下，BamA蛋白始终在DGC纯化下富集，该蛋白是外膜蛋白组装复合物的一部分，先前在EcNEVs的蛋白质组学分析中也得到鉴定，因此BamA蛋白有望成为鉴定EcN的纯化标志物。

3.4 SEC法

SEC也称为凝胶过滤，其分离原理是基于不同粒径颗粒在流经多孔材料（聚合物或二氧化硅基）时表现出的差异洗脱特性，EVs颗粒尺寸较大限制了它们与色谱柱填料的相互作用，因此EVs在第一批馏分中被回收，而小颗粒的蛋白质和其他污染物通过进入聚合物的孔而减慢速度，因此它们比EVs洗脱得晚。相较于超速离心法，SEC更容易实现，耗时更短，且能更好保持益生菌EVs的结构和功能完整性。Rodovalho等比较了密度梯度离心联合超速离心法和SEC法分离费氏丙酸杆菌CIRM-BIA129-EVs的差异，两种方法分离的EVs粒径均在75～90 nm之间，但SEC分离的EVs产率更高，且蛋白回收率明显下降。不同的分离方法选择了不同的EVs亚群，这些亚群的蛋白质含量不同，因此难以客观评估EVs纯度的问题。

3.5 阴离子交换色谱法

阴离子交换色谱法的基本原理是依靠带正电荷的基质结合带负电荷的分子，同时洗去中性或带正电荷的分子，然后用高离子强度缓冲液洗脱结合的分子。由于大多数益生菌EVs表面带负电荷，因此阴离子交换色谱法也可以应用在益生菌EVs的分离。Pirol Li等开发了一种高效阴离子交换色谱与切向流过滤串联的基于尺寸和电荷的EVs富集方法，与单独使用基于体积的方法相比，该方法可以有效减少EcN-EVs中共分离的杂质鞭毛蛋白，且增强乳酸菌-EVs的抗炎活性。

4 益生菌EVs的生物活性

益生菌EVs具有诸多有益于宿主的生物活性，如调节肠道微生物稳态、炎症免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、改善神经性疾病等（表2）。

4.1 益生菌EVs的炎症免疫调节活性

益生菌EVs调节炎症免疫活性有两种方式，它们之间相互影响（图3）。一是直接通过内化进入宿主细胞，将效应分子递送到细胞内，激活多种模式识别受体信号通路，从而激活宿主的先天免疫和适应性免疫应答；二是通过与宿主微生物相互作用调控肠道微生物稳态，并增强肠上皮屏障功能协同实现宿主免疫系统的动态平衡。

益生菌EVs携带的蛋白质以及胞壁成分（肽聚糖、脂磷壁酸等）通过内化被先天免疫细胞的模式识别受体（Toll样受体（TLR）和NOD样受体）识别，从而刺激巨噬细胞和树突状细胞激活先天性免疫。例如，鼠李糖乳杆菌JB-1-EVs含有的脂磷壁酸可以激活TLR2并以内化依赖性方式诱导树突状细胞免疫调节抗炎因子IL-10的表达；益生菌大肠杆菌O83-EVs通过其内容物（脂蛋白和鞭毛蛋白等）激活模式识别TLR2/4/5和NOD1/2，从而刺激小鼠的先天性免疫反应。先天免疫细胞通过分泌细胞因子能够调控适应性免疫的强度和方向。因此，益生菌EVs同样能够激活宿主的适应性免疫应答。例如，植物乳植杆菌-EVs中脂蛋白19180来源的

N

宿主的肠道微生物群与炎症免疫反应密切相关，益生菌EVs的抗炎作用亦可归因于宿主肠道微生物稳态的改善。益生菌EVs富含一些抑菌物质，如抗菌肽等，它们能有效抑制病原菌的繁殖与扩散。例如，植物乳植杆菌Q7-EVs能够显著抑制结肠炎小鼠肠道中促炎菌变形菌门的增殖，且富集了乳酸菌属和双歧杆菌属等抗炎菌群，并改善结肠炎症状。同样在小鼠结肠炎模型中，AKK-EVs能够显著改善肠道微生物群组成，并通过促进杯状细胞分泌黏蛋白（MUC）-2的表达和维持肠道黏液层厚度调节肠黏膜免疫。益生菌EVs与宿主肠上皮细胞的黏附能力是其抑制病原菌定植并强化肠道屏障的关键因素。研究发现，费氏丙酸杆菌CIRM-BIA 129-EVs依赖其表面蛋白SlpB增强与肠上皮细胞的黏附能力，SlpB蛋白通过调节代谢物和免疫调节分子以减轻肠道炎症。在另一项研究中，SlpB蛋白可增强乳酸乳杆菌NCDO 2118在结肠炎小鼠模型中的抗炎活性，显著上调MUC-2和紧密连接蛋白ZO-1的表达。

4.2 益生菌EVs改善神经性疾病的活性

肠道菌群通过复杂的双向通信系统与大脑进行交流，称之为肠-脑轴。肠-脑轴通过神经递质、免疫系统、内分泌介质或细菌代谢产物将外周肠道与大脑中心联系在一起。肠道菌群紊乱可能会导致一系列神经系统疾病，包括抑郁、焦虑、精神分裂症、自闭症以及帕金森病等。益生菌EVs中的重要胞内成分miRNA和其他活性因子可能作为微生物群-肠道-脑轴双向通讯的新型调控枢纽介导神经性疾病的改善。最新的研究发现，益生菌EVs能够直接穿透血脑屏障被中枢神经细胞内化，从而影响神经炎症和功能认知障碍。此外，益生菌EVs通过改善肠道屏障功能和血脑屏障功能，有效抑制炎症因子的释放和有害物质进入大脑，从而抑制神经炎症和神经退化。

益生菌EVs中的生物活性成分可以减轻神经系统内的炎症反应并限制炎症介质的释放。例如，鼠李糖乳杆菌ATCC 7469-EVs通过上调精氨酸酶的mRNA表达诱导抗炎的M2型小胶质细胞激活，从而改善了LPS诱导的炎症性神经系统疾病。M2小胶质细胞作为大脑中先天免疫细胞在改善中枢神经系统损伤至关重要。此外，研究还发现AKK-EVs能够通过增强肠道屏障和血脑屏障性能抑制小胶质细胞介导TLR2/4信号诱导的神经炎症。益生菌EVs还可以影响神经传导通路，增强神经信号的传递和调节。研究发现，植物乳植杆菌-EVs、枯草芽孢杆菌-EVs、AKK-EVs以及副干酪乳杆菌-EVs均可恢复应激诱导变化的海马体神经营养因子（如BDNF、甲基-CpG结合蛋白2等）表达，从而缓解压力诱导的抑郁样行为。

4.3 益生菌EVs的抗病毒活性

当宿主肠道微生物群受到不利因素影响（如不健康饮食或使用抗生素类药物）失去平衡时，外源性或共生微生物更有可能侵入机体。益生菌能够改变肠道菌群的组成，调控肠道微生物稳态，从而抵抗病毒感染。考虑到免疫功能低下个体食用益生菌的风险，新的病毒感染生物治疗策略从益生菌转向后生元。研究表明，益生菌EVs主要通过激活宿主的免疫调节对抗病毒的侵入。此外，益生菌EVs还可以直接作用于包被在病毒外层的糖蛋白，从而抑制病毒与宿主受体的结合。

益生菌EVs通过激活宿主的免疫应和改善肠道屏障功能，从而协同抵抗病毒颗粒的入侵。在轮状病毒感染的新生大鼠模型中，益生菌EcN-EVs的干预刺激了大鼠的体液免疫和细胞免疫，可显著上调血浆IgA、IgM、IgG水平和脾淋巴细胞的自然杀伤细胞、杀伤T细胞、γδT细胞水平，并显著改善病毒感染大鼠杯状细胞产生和黏蛋白MUC-2表达，从而缓解大鼠因轮状病毒感染引起的腹泻症状。致炎细胞因子IL-17参与先天性和适应性免疫应答，在宿主防御细菌和真菌感染以及自身免疫性疾病的发病机制中起关键作用。Zhou Hongxia等研究发现，罗伊氏乳杆菌EHA2-EVs可通过减弱IL-17信号传导减轻甲型流感病毒的感染，其中罗伊氏乳杆菌EHA2-EVs中的miRNA-4239在IL-17A表达中起关键调节作用。此外，乳酸菌-EVs展现出一种新型抗病毒机制：通过直接靶向介导囊膜病毒入侵宿主的包膜糖蛋白，有效抑制囊膜病毒对靶细胞的附着和入侵。以人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）为例，其Env蛋白是负责与宿主细胞受体结合的包膜糖蛋白。Ñahui Palomino等研究发现从健康女性阴道分离的卷曲乳杆菌BC3-EVs和加氏乳杆菌BC12-EVs通过显著降低HIV-1的Env蛋白浓度，从而有效保护离体组织和分离细胞免受HIV-1感染。

4.4 益生菌EVs的抗肿瘤活性

癌症是一种具有高度临床意义的致命恶性肿瘤，是导致疾病和死亡的主要原因之一。最近的研究发现，益生菌EVs在癌症的预防和治疗方面显示出潜力。它们可以抑制肿瘤细胞增殖、防止肿瘤转移和侵袭、重塑肿瘤微环境、激活宿主的抗肿瘤免疫反应以及调节癌细胞的糖酵解重编程。此外，益生菌EVs独特的生物相容性可能在癌症治疗中起决定性作用。

益生菌EVs携带的蛋白质、mRNA和miRNA分子能够直接作用于癌细胞，通过激活肿瘤细胞的凋亡通路（Bcl2/Bax信号通路等）抑制肿瘤细胞的增殖和生长。Behzadi等将不同质量浓度的鼠李糖乳杆菌-EVs（LDEVs）处理人肝癌细胞HepG2，发现100 μg/mL的LDEVs对癌细胞具有显著细胞毒性作用，且50 μg/mL和100 μg/mL的LDEVs均显著增加了癌细胞凋亡指数（

bax/bcl-2

bax/bcl-2

bcl-2

4.5 益生菌EVs改善糖脂代谢紊乱的活性

肥胖和糖尿病关系密切，通常表现为胰岛素抵抗、高血糖、血脂水平异常和全身性低度炎症。研究表明，益生菌EVs可通过多途径协同改善糖脂代谢紊乱：维持肠道微生物稳态、增强肠道菌群屏障功能、改善炎症因子分泌、促进肠道菌群相关的有益代谢产物产生等。此外，益生菌EVs中的核心蛋白成分可能是益生菌改善糖脂代谢紊乱的核心机制。

益生菌EVs能够调整肠道微生物群组成，促进肠道中有益代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）的产生。临床研究显示，SCFAs可以改善2型糖尿病患者的血糖、体质量及胰岛素抵抗，并提高葡萄糖耐量。Shi Jun等研究发现，EcN-EVs的干预可以改善肠道中厚壁菌门/拟杆菌门的比例，提高生产SCFAs的菌群，并增加SCFAs含量，从而有效改善肥胖和糖尿病的病理状态。益生菌EVs调控糖脂代谢紊乱的作用机制与益生菌相似，但其功效存在一定的差异。Ashrafian等评估了AKK活菌、AKK死菌以及AKK-EVs对HFD小鼠的改善肥胖作用，研究表明，3 种方式均通过显著改善肠道微生物稳态、增强肠道黏膜屏障以及抑制结肠、脂肪组织和肝脏炎症缓解了小鼠的肥胖和高血糖。然而，AKK-EVs在控制小鼠体质量、脂肪代谢和血糖方面优于AKK活菌和AKK死菌。益生菌EVs中的核心蛋白成分在调节代谢紊乱中发挥关键作用。AKK-EVs中的外膜蛋白Amuc_1100能够通过激活特定的腺苷酸环化酶3/蛋白激酶A/激素敏感性脂肪酶通路通路促进脂肪分解和褐变，并在改善肠道菌群、抑制炎症细胞浸润以及维持宿主胃肠道的免疫稳态中发挥重要作用。另一项研究表明，从AKK菌外膜中分离出一种特异性蛋白P9蛋白可能是AKK菌调节糖脂代谢紊乱的关键。P9蛋白通过与细胞间黏附分子2结合后激活了肠道内胃肠激素胰高血糖素样肽1的分泌，从而促进机体产热改善HFD小鼠的肥胖和葡萄糖稳态。

4.6 益生菌EVs的靶向载体运输活性

近年来，益生菌EVs因其低毒性、低免疫原性以及穿透生理屏障的能力，被视为药物递送系统的理想载体。益生菌EVs与其他药物递送系统（如聚合物纳米颗粒和脂质体）相比具有显著优势，它们的脂质双层膜结构能够包埋多种药物，包括化学药物、蛋白质和核酸。临床广泛使用的抗癌药物（如阿霉素、异长春花碱等），其疗效受到药物溶解度差、半衰期短、系统毒性大以及靶向性差等因素的限制。研究发现，将药物加载到EVs中可以有效提高药物稳定性和生物利用度，并最大限度地提高其在病变部位的保留率。例如，布拉氏酵母菌CNCM I-745-EVs能够成功地将阿霉素递送到人肠细胞系中，细胞毒性测试进一步证实了转移后的阿霉素保留了其生物活性。此外，益生菌EVs的高工程性，有望为多种疾病的无细胞疗法带来希望。Liu Han等将骨靶向肽锚定在鼠李糖乳杆菌-EVs上，能使鼠李糖乳杆菌-EVs将内在的miRNA递送到骨微环境，并且改进后的益生菌EVs无显著毒性。此外，Wo Jing等建立了基于EcNEVs的疫苗递送系统，成功同时递送了含有新冠病毒刺突蛋白的受体结合域及受体结合域非糖基化区域NG06抗原，并展现出良好的免疫原性和安全性。总体而言，可通过生物工程手段对益生菌EVs进行定向改造，使其具备特定的功能或靶向性。

5 益生菌EVs在食品领域的潜力和挑战

5.1益生菌EVs在食品领域的潜力

益生菌因其良好的功能特性，在饮料、蔬菜、肉制品、果蔬汁、零食、豆制品等食品工业中都拥有广阔的市场前景。益生菌EVs拥有着与益生菌相类似的生物活性，并在某些方面的效果要优于益生菌。因此，益生菌EVs在功能性食品领域具有良好的应用前景（图4）。益生菌EVs通过调节肠道微生物组成和增强肠道屏障功能为人类提供了一种维护肠道健康的功能性食品。呕吐毒素是食品和饲料中常见的霉菌毒素污染物，它会导致人类肠道菌群紊乱和肠道屏障的破坏。鼠李糖乳杆菌-EVs通过激活TLR2信号通路促进巨噬细胞极化为抗炎的M2表型，从而释放抗炎因子IL-10，减轻呕吐毒素诱导的肠道屏障破坏。益生菌EVs还可以作为一种新型的免疫调节剂，减轻食物过敏反应。例如，长双歧杆菌-EVs通过特异性诱导肥大细胞的凋亡抑制小鼠的食物过敏反应。此外，益生菌EVs具有改善糖脂代谢紊乱的潜力，有望成为一种新型的“减肥食品”。

益生菌EVs在食品领域中还能够作为递送食品功能性成分的载体，增强食品功能因子的稳定、提高生物利用度以及实现特殊疾病位点的靶向递送。例如，黄芩苷是从双子叶唇形科植物黄芩的干燥根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有抑菌、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成等生物活性。然而，其存在水溶性差和生物利用度低的缺陷。针对这一问题，EcN-EVs被证明可作为黄芩苷的高效生物纳米载体，不仅可以有效解决其水溶性差和生物利用度低的问题，更在结直肠癌的靶向治疗中展现出独特潜力。类似的递送策略也拓展至其他活性成分，以常用得到食品着色剂岩藻黄质（FX）为例，这类天然色素因具有抗肿瘤、抗炎及抗氧化等生物活性而被广泛研究。Liang等创新性地使用植物乳植杆菌lp90-EVs（SyMVs）对FX进行包封，结果表明SyMVs不仅可以有效提高FX溶解度和稳定性，还可以通过增强细胞吸收和肠道滞留有效提高FX的生物利用度。此外，动物实验进一步验证了该递送系统的安全性。

益生菌EVs富含的抗菌肽等抑菌成分，能够有效抑制病原微生物的生长并防止生物膜的形成。并且，益生菌EVs中的抗氧化成分还能够有效阻止食品的氧化。因此，益生菌EVs作为新型抗菌剂在提高食品品质以及安全性中展现出巨大潜力。Lee等将植物乳植杆菌-EVs涂覆在金枪鱼表层后，结果显示植物乳植杆菌-EVs能够显著抑制氧化反应，降低总挥发性碱基氮、过氧化值、丙二醛和腐败希瓦氏菌属水平，从而有效的提高金枪鱼的品质和保质期。

5.2 益生菌EVs在食品领域的挑战和局限性

益生菌EVs因其良好的生物活性越来越受到研究者的青睐。然而，益生菌EVs应用到食品领域还存在不少的挑战（图4）。目前，益生菌EVs的认识仍处于初步阶段，大部分的研究集中在益生菌EVs对宿主的健康效应上，而益生菌EVs与宿主相互作用产生健康效益的具体机制还不清晰。因此，未来还需要更多的研究去挖掘益生菌EVs的不同生物活性，并深入揭示其生物作用机制。

益生菌EVs在实际应用中仍面临多重技术瓶颈，首要问题在于其生产、表征及储存环节均缺乏标准化流程。益生菌EVs生产效率低，生产条件复杂。同时，高质量的EVs还依赖特定的分离机器与工艺参数，进一步提高了生产成本和技术门槛。储存方面，益生菌EVs需在—80 ℃超低温环境中保存以维持稳定性。研究表明，即使在超低温条件下长期保存仍会以时间依赖性方式导致浓度与纯度下降，并伴随颗粒尺寸增大、表面电位改变等理化性质劣化现象。此外，益生菌EVs的浓度受多种变量影响，包括菌株特异性、分离方法的选择、培养基成分及培养条件（如温度、pH值）等因素。因此，益生菌EVs剂量与其产生的健康作用的量效关系也难以确认。

益生菌EVs在应用于食品市场前，应该系统地程序化检验其安全性。尽管多项研究表明益生菌EVs对宿主细胞未产生明显的毒性作用，然而考虑到益生菌EVs的纳米特性，它几乎可以到达到身体的各个组织器官。因此，需要进一步研究益生菌EVs在不同类型人类细胞中的安全性。此外，益生菌EVs在调节宿主免疫反应方面表现出巨大的潜力，但大部分动物实验的干预周期普遍较短（2～5 周），针对大样本量的长期摄入（如慢性毒理实验）仍缺乏系统性评估体系。因此，对益生菌EVs的安全性评价还需要长时间的深入研究和检测。

结 语

大量的研究证实了益生菌EVs携带的蛋白质、核酸、脂质等成分在保护肠道屏障稳态和激活宿主的免疫调节发挥重要作用。此外，益生菌EVs的抑菌性、低毒性、低免疫原性等生物活性，在功能性食品的开发、食品中功能活性成分的递送以及食品的保存中均具有一定的应用潜力。尽管益生菌EVs展现出广阔的应用潜力，但其在实际应用前仍面临着不小的挑战。目前，益生菌EVs生产效率低，其单一的分离方法具有局限性，并且对表征益生菌EVs的理化性质、蛋白组分等关注不够，导致益生菌EVs的纯度难以用具体数据量化。此外，益生菌EVs与宿主细胞以及肠道微生物的相互作用机制尚不清晰，尤其是靶向递送的相关机制。未来亟需整合合成生物学、基因编辑及代谢工程等前沿技术，系统优化益生菌EVs的规模化制备工艺，重点突破其产量稳定性、活性保持及跨尺度递送效率等核心瓶颈。通过多组学联用与仿生模型构建，深入解析工程化益生菌来源EVs与宿主肠道微生态的互作网络，阐明其在免疫调节、代谢干预及屏障修复中的分子机制，为精准营养干预提供理论支撑。基于合成生物学驱动的功能定制化设计，加速EVs在功能性食品添加剂、活性成分靶向递送系统及新型益生制品开发等领域的应用，推动食品产业向精准化、功能化方向转型升级。

作者简介

通信作者

关荣发， 浙江工业大学工业技术转化与推广中心副处长 。 浙江省万人科技创新领军人才，浙江省151人才，国家特殊医学用途配方食品和特殊膳食食品委员会委员，浙江省食品学会党支部副书记，浙江省食品学会青年委员会副主任委员，浙江省营养学会理事。以第一或主要参与者获得过浙江省科学技术奖一等奖二项、中国商业联合会科技进步特等奖、中国商业联合会科技进步一等奖、中国商业联合会科技进步二等奖、中国轻工业联合会科学技术奖二等奖、浙江省高校优秀科研成果奖二等奖、第十二届全国多媒体课件大赛一等奖、浙江省自然科学优秀论文二等奖、浙江省高校教师软件评比三等奖等奖。作为主持人或主要参加者获国家自然科学基金面上项目、国家“十三五”重点项目、国家“十二五”科技支撑项目、国家质检总局公益科技项目、国家高技术研究发展计划（863计划）项目、国家标准委项目、浙江省重点研发项目、浙江省自然科学基金，浙江省级公益性技术应用研究计划项目，浙江省科分析测试科技计划项目和浙江省质量技术监督系统科研计划项目等项目。主编教材六部，发表SCI和EI等高级别论文100多篇，申请国家发明专利12 件，国际发明专利10 件，目前已经授权15 件，其中国际专利7 件。

第一作者

钟浩， 浙江工业大学食品科学与工程学院讲师 。 主要从事益生菌、生物活性肽、花色苷的营养学和靶向递送等多学科交叉领域的基础与应用研究。2021年3月毕业于浙江大学，获得食品科学博士学位。目前主持浙江省“尖兵领雁+X” 研发攻关计划项目、国家自然科学基金青年项目、浙江省自然科学基金探索青年项目、中国博士后科学基金面上基金、企业委托横向课题等科研项目10余项；以研究骨干参与多项国家级科研项目。在

Advanced Science、Food Chemistry、Critical Reviews in Food Science and Nutrition

Biology-Basel

Gut Microbes、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Molecular Nutrition & Food Research

引文格式：

钟浩, 汤宁, 刘晓凤, 等. 益生菌胞外囊泡的分离、生物活性及应用研究进展[J]. 食品科学, 2025, 46(17): 314-325.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241230-255.

ZHONG Hao, TANG Ning, LIU Xiaofeng, et al. Advances in the structure, separation, bioactivities and applications of probiotic extracellular vesicles[J]. Food Science, 2025, 46(17): 314-325. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241230-255.

实习编辑：杨琼；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网