浪淘沙：西湖大学卢培龙/马丹/陈子博等实现膜转运蛋白的从头设计，为靶向药物递送开辟新途径

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

跨生物膜的分子转运对于生命活动至关重要，它使细胞能够获取营养、排出废物、维持细胞稳态并与环境进行信息交互。尽管跨膜功能蛋白的从头设计已取得一定进展，但如何构建能够稳健、选择性转运特定小分子的人工跨膜转运体系，仍是一项重大挑战。

近日，西湖大学卢培龙、马丹、陈子博等在“浪淘沙预印本平台”发布了题为：De novo design of dual-topology membrane transporters 的研究论文。

该研究从头设计了双拓扑结构的膜转运蛋白（dual-topology membrane transporter），这些设计蛋白能在活细胞和人工囊泡中介导小分子染料的选择性摄取，其功能类似于天然单向转运蛋白。冷冻电镜结构分析显示，其实际构象与设计模型高度吻合，功能实验验证了双拓扑结构及其作用机制。

这项研究证实了以原子级精度从头设计功能性动态膜转运蛋白是可行的，为了解转运蛋白的进化起源提供了新视角，并为靶向药物递送、代谢通路工程等应用开辟了新途径。

膜转运蛋白：生命的“守门人”

生物膜是细胞的屏障，控制着物质进出。膜转运蛋白就像是细胞膜上的“智能门卫”，负责选择性转运离子、营养物质、药物分子等，维持细胞稳态。如果设计出人工转运蛋白，就能精准控制细胞对特定物质的吸收和排出，这在药物递送、代谢工程等领域具有巨大应用潜力。

然而，设计功能性膜转运蛋白极具挑战性。它需要精确的三维结构、特定的膜拓扑取向、底物识别能力，以及关键的构象动态变化——转运蛋白需要在“内向”“闭塞”和“外向”等状态间切换，像“呼吸”一样实现物质转运。

巧借对称性：双拓扑设计简化动态机制

研究团队创新性地采用了“双拓扑”设计策略。天然转运蛋白中，EmrE 等少数蛋白采用这种架构：单体以相反方向插入膜中，形成反平行二聚体。由于结构对称，内向和外向构象的能量接近，只需设计一个对称的、底物结合的“闭塞状态”，就能利用热力学驱动构象切换，实现被动转运。

研究通过参数化方程生成具有 C2 对称性的六螺旋束骨架，中央预留底物结合口袋。研究团队选择近对称的染料分子 Cy3 作为模型底物，利用 Rosetta 和 ProteinMPNN 等设计工具优化蛋白-配体界面和序列。

设计中，在膜-水界面引入两环两亲性芳香族残基，平衡正电荷分布，确保蛋白能双向插入生物膜中。计算筛选出 216 个设计蛋白，最终 50 个进入实验验证。

高效转运：细胞和人工囊泡中验证功能

在基于大肠杆菌的底物摄取实验中，25 个设计蛋白显示出强烈的 Cy3 染料积累，活性比对照组高出 13 倍以上。这些设计对 Cy3 表现出高度特异性，而对结构相似的 Cy3 DA 或其他染料如 Lucifer yellow 和 Calcein 则几乎无转运。

转运活动呈时间和浓度依赖性，动力学参数与天然转运蛋白相当。竞争实验表明，Cy3 和 Lucifer yellow 共存时，设计蛋白选择性转运 Cy3，证实了路径特异性。

点突变和化学修饰实验进一步验证了设计结合口袋的功能性。例如，将非极性氨基酸残基突变为带负电的氨基酸残基会抑制转运；在 Trans42_I7C 突变体中，MTSES 处理显著抑制 Cy3 摄取，说明关键氨基酸残基直接参与转运。

结构精准：冷冻电镜揭示原子级设计准确性

尽管转运蛋白尺寸小，研究团队通过融合刚性辅助域（例如 BRIL 或 MBP-DARPin）成功解析了 Trans25-sol 和 Trans42-TM 的冷冻电镜结构，分辨率分别达 2.93 Å 和 3.40 Å。

结构显示，跨膜域与设计模型高度一致，Cα RMSD 仅 1.2 Å 和 0.5 Å。中央空腔为底物结合位点，通道狭窄（半径约 1.3 Å），需构象变化才能允许底物通过。分子对接表明 Cy3 能完美契合设计位置。

体外和拓扑验证：功能广泛适用

在无细胞的巨型单层囊泡（GUV）中，表达设计转运蛋白的囊泡显示 Cy3 荧光随时间衰减，表明设计蛋白介导了底物外排。无功能的突变体则无此效应，MTSES 敏感性也与细胞实验一致。

split-GFP 互补实验证实了双拓扑插入：当蛋白 N 端和 C 端同时融合 GFP 片段时，荧光强烈，说明两端位于膜同侧。单链版本仍保持转运活性，支持了设计模型的合理性。

从设计到进化：启示转运的起源

许多天然转运蛋白（例如 MFS 超家族）显示内部三重跨膜（3-TM）倒置重复，提示它们可能由原始 3-TM 双拓扑模块通过基因复制融合演化而来。该研究设计的 3-TM 双拓扑蛋白正好为这一假说提供了证据，展示了最小对称单元如何实现定向转运。

应用前景：定制化转运蛋白时代

这项研究不仅证明了从头设计动态膜蛋白的可行性，还开辟了广泛应用：

• 靶向药物递送：设计特异性转运抗癌药物的蛋白，实现精准治疗。

• 细胞工厂：在工程化代谢途径中控制化学物质进出，提高产量。

• 基础研究：作为模型系统研究膜蛋白折叠、动态和进化。

总的来说，该研究通过深度学习和计算设计，首次实现了功能完备的膜转运蛋白的从头设计。这些蛋白结构精准、动态智能、功能可靠，标志着蛋白质从头设计领域迈入新纪元。

“浪淘沙预印本平台”（LangTaoSha Preprint Server）于 2025 年 11 月正式上线，是由深圳医学科学院（SMART）与深圳湾实验室、清华大学、西湖大学以及其他顶尖高校和研究机构合作建立的一个由科学家主导的开放科学平台。

该平台旨在为生命科学领域的研究人员提供了一个高效、可靠且开放的学术交流环境。平台支持研究成果在正式同行评议前的快速传播，鼓励实时讨论，促进更广泛的科学合作。此外，该平台还引入了区块链技术，为每一篇上线的论文生成独一无二且不可更改的时间戳与加密凭证，以确保科学记录的完整性和可追溯性。最终目标是构建一个更透明、高效且有影响力的全球科学生态系统。

论文链接：

https://langtaosha.org.cn/index.php/lts/en/preprint/view/74