Cyanine7.5-Heparin的纯化与表征

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产品名称：Cyanine7.5-Heparin的纯化与表征
1. 合成策略与反应机制
化学偶联原理
肝素（天然多糖，含羧基和磺酸基）通过EDC/NHS活化羧基，与乙二胺反应引入伯胺基团（Heparin-NH₂），作为偶联位点。
CY7.5-NHS酯（近红外荧光染料，激发波长750 nm，发射波长775-810 nm）与Heparin-NH₂在pH 7.5-8.5缓冲液中反应，形成稳定酰胺键。染料与肝素摩尔比通常为1:5至1:20，平衡荧光强度与生物活性。
关键参数控制
反应条件：温度4℃/室温，避光操作，避免DBCO光降解或酸碱副反应。
标记密度：通过摩尔比调控，确保肝素生物活性（如抗凝血功能）不受显著影响。
2. 纯化步骤与优化
透析纯化
使用MWCO 3.5-10 kDa透析膜，去除游离CY7.5染料和小分子副产物，操作需在避光、4℃条件下进行，防止染料降解。
透析后冷冻干燥得深蓝至紫色固体粉末，纯度≥95%。
色谱法纯化
分子筛层析（SEC）：分离游离染料与标记产物，提升单分散性。
离子交换色谱：利用肝素负电荷特性，通过阳离子/阴离子交换柱进一步纯化，减少非特异性吸附。
HPLC验证：采用C18柱或凝胶过滤柱，检测纯度及偶联效率，保留时间与标准肝素对比确认结构完整性。
其他方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：荧光扫描观察标记产物分布，评估均一性。
超滤离心：快速去除小分子杂质，适用于实验室规模纯化。
3. 表征技术与验证
光谱学分析
UV-Vis/荧光光谱：确认CY7.5吸收峰（约750 nm）与发射峰（775-810 nm），荧光强度与标记密度成正比，用于定量分析。
圆二色谱（CD）：监测肝素二级结构是否因偶联发生改变，确保生物活性保留。
结构表征
NMR（¹H/¹³C）：分析化学位移变化，确认染料偶联位点及肝素骨架完整性，排除降解产物。
质谱（MS）：测定分子量增加及偶联比例，验证结构（如MALDI-TOF检测偶联后分子量）。
X射线光电子能谱（XPS）：分析表面元素组成，确认偶联成功。
功能验证
生物活性测试：抗凝血活性实验（如APTT/TT检测）、细胞结合实验（如与肝素结合蛋白HBPs的亲和力），确保标记后肝素功能不受损。
活体成像：小动物近红外成像系统追踪体内分布、代谢动力学及肿瘤富集（EPR效应），评估靶向效率。
分子相互作用研究：荧光偏振/FRET技术分析肝素与蛋白质（如凝血因子、生长因子）的结合常数及动力学。

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