血清保存实操指南

一、前言：血清保存的科研价值与核心痛点

在研究生细胞实验中，血清是维持细胞活性的 “关键试剂”—— 某细胞传代实验因血清反复冻融，导致细胞凋亡率升至 35%；某病毒包装课题因热灭活不当，血清中生长因子活性降低 40%，延误病毒制备周期。这类问题并非血清本身质量缺陷，多是对保存细节与操作规范把控不足。

血清保存看似 “简单冷藏”，实则 80% 的实验失败源于 “操作误区”：冷冻时未留膨胀空间导致炸瓶污染、盲目二次过滤堵塞营养成分、37℃放置过久引发蛋白质变性。本文结合 15 年细胞实验经验与行业标准，从冷冻管理到沉淀物鉴别，拆解全流程避坑要点，帮研究生避开 “血清浪费” 与 “细胞损失”，让细胞培养既稳又顺。

二、冷冻保存：3 招锁住血清活性

（一）温度分级管理：长期短期精准适配

血清活性对温度极其敏感，需按使用周期选择保存温度，避免 “一刀切” 式存储：

1. 长期保存（＞1 个月）：需放入 - 20℃~-70℃低温冰箱（优先选 - 70℃，活性保留更久），且必须分装为 10~50mL 小份（单次用量最佳）—— 反复冻融 3 次以上，血清中白蛋白、生长因子活性会下降 25% 以上，直接影响细胞贴壁与增殖。

2. 短期使用（≤1 个月）：4℃冷藏即可，但需注意 “时效红线”—— 超过 1 个月，血清中补体系统会缓慢激活，可能引发细胞非特异性凋亡，尤其对免疫细胞（如 T 细胞、巨噬细胞）影响更显著。

（二）防爆管关键操作：预留 10% 膨胀空间

血清结冰后体积会膨胀 8%~12%，若灌装过满，冻融会导致离心管炸裂，污染冰箱与其他试剂。正确操作：

• 选择带刻度的无菌离心管，灌装血清时液面距管口至少 1cm（如 50mL 离心管最多装 45mL 血清），确保有足够膨胀空间；

• 冻存前贴好标签，标注 “血清批次 + 分装日期 + 保存温度”，避免与其他试剂混淆，同时方便追溯使用周期。

（三）冰箱管理：避免交叉污染

• 低温冰箱需分区存放：血清单独放在上层抽屉，与试剂（如抗生素、胰酶）分开，避免试剂泄漏污染血清；

• 取用时快速操作：从 - 70℃冰箱取出血清后，立即放入 4℃冰箱解冻，避免在室温下暴露超过 5 分钟，减少冷凝水混入导致的污染风险。

三、过滤操作：别让 “多此一举” 毁了血清

（一）出厂灭菌认知：无需二次过滤

市售合格血清（如胎牛血清、小牛血清）出厂前已通过 0.1μm 无菌滤膜过滤，达到细胞培养级无菌标准。

核心禁忌：不可直接对纯血清进行二次过滤 —— 血清中脂蛋白、纤维蛋白易堵塞滤膜，不仅导致过滤失败，还会吸附血清中的生长因子（如 EGF、IGF），降低血清活性。

（二）悬浮物处理：混合后过滤才正确

若血清解冻后出现少量絮状悬浮物（正常现象，非污染），正确处理流程：

1. 先将血清与细胞培养基按比例混合（如 10% 血清 + 90% 培养基）；

2. 用 0.22μm 无菌滤膜过滤混合液（不可用 0.1μm 滤膜，会过度截留营养成分）；

3. 过滤后的混合液需在 24 小时内使用，避免长时间存放导致微生物滋生。

注意：若悬浮物呈黑色颗粒或伴随异味，可能是血清污染，需立即停用，不可过滤后继续使用。

四、解冻方法：三步化冻法拒绝 “暴力操作”

（一）标准解冻流程：低温过渡防凝集

血清中蛋白质对温度骤变极其敏感，37℃水浴直接解冻会导致蛋白质变性凝集，形成不可逆沉淀。正确三步法：

1. -20℃/-70℃→4℃：将冻存血清从低温冰箱取出，放入 4℃冰箱冷藏 24 小时（完全解冻后血清呈淡黄色透明状，无明显沉淀）；

2. 4℃→室温：取出解冻后的血清，在室温下放置 10~15 分钟，待温度升至 15~20℃；

3. 轻柔混匀：用手握住离心管中部，缓慢颠倒 5~8 次（避免剧烈摇晃产生气泡，气泡会破坏血清中的活性成分）。

（二）常见解冻误区：这些操作要避开

• 误区 1：-20℃血清直接放入 37℃水浴 ——10 分钟内温度骤升 50℃，蛋白质凝集率达 60% 以上，血清会变浑浊；

• 误区 2：解冻后长时间室温放置 —— 超过 2 小时，血清中微生物污染风险会增加 3 倍，尤其夏季室温＞25℃时；

• 误区 3：未混匀直接使用 —— 血清中营养成分分布不均，会导致细胞生长速度差异，影响实验重复性。

五、热灭活：能不做就不做的 “双刃剑”

（一）热灭活适用场景：仅限特殊实验

热灭活的核心目的是破坏血清中的补体系统（如 C3、C5），仅适用于特定实验：

• 免疫相关实验（如细胞毒性检测、补体介导的细胞裂解实验）；

• 部分敏感细胞系培养（如胚胎干细胞、神经细胞）。

非必要不做：常规细胞培养（如 HeLa、293T 细胞）无需热灭活，反而会导致以下问题：

1. 血清中生长因子（如 FGF）活性降低 15%~30%；

2. 蛋白质变性产生更多沉淀物，增加细胞吞噬风险；

3. 操作不当（如温度超 56℃）会直接导致血清报废。

（二）规范热灭活操作：56℃×30 分钟

若必须热灭活，需严格控制条件：

1. 水浴锅提前预热至 56℃，并校准温度（误差≤±0.5℃）；

2. 将解冻混匀的血清放入水浴锅，全程轻轻摇晃（每 5 分钟摇晃 1 次），确保温度均匀；

3. 30 分钟后立即取出，放入冰浴中快速降温至室温，避免长时间高温影响活性。

六、沉淀物鉴别：3 类异常精准应对

血清解冻后出现沉淀物是常见现象，需根据类型差异化处理，避免误判污染导致浪费：

关键提醒：若无法判断沉淀物类型，或镜检发现微生物活动（如细菌鞭毛运动、真菌菌丝），需停止使用该批次血清。若涉及关键实验（如动物实验、临床样本相关研究），可依托科易猫科研检测的血清品质检测服务，通过无菌验证、活性评估，确保血清无风险后再使用。

七、实验小贴士与参考资料

（一）实验小贴士（科研经验总结）

• 批次选择技巧：优先选择同一批次血清完成整个课题（如细胞传代、药物筛选），不同批次血清成分差异会导致实验数据波动；

• 节约使用方法：短期内用不完的血清（4℃保存＞2 周），可分装为 5mL 小份，再次冻存于 - 70℃，减少反复冻融次数；

• 应急处理方案：若血清意外污染（如洒落、瓶口接触污染物），不可灭菌后继续使用，需立即丢弃，避免交叉污染其他试剂。

（二）参考资料

[1] GB/T 29778-2013 细胞培养用牛血清（国家标准）

[2] 《动物细胞培养 —— 基本技术指南》（科学出版社，2023 年版）

[3] 《细胞生物学实验教程》（高等教育出版社，2024 年版）

[4] 胎牛血清保存与使用常见误区分析（《细胞与分子免疫学杂志》，2023 年第 39 卷）

[5] 《生物试剂管理规范》（化学工业出版社，2022 年版）

八、总结

血清保存的核心是 “温度控制 + 细节把控”—— 从冷冻时的膨胀空间预留，到解冻时的低温过渡，再到沉淀物的精准鉴别，每一步都直接影响血清活性与细胞培养结果。研究生需摒弃 “简单存储无需重视” 的误区，将规范操作融入血清管理全流程，才能为细胞实验筑牢 “试剂基础”。

若在血清品质判断（如活性评估、污染鉴别）、关键实验血清验证（如干细胞培养、病毒包装）中遇到难题，或需第三方检测确保血清可靠性，可依托科易猫科研检测的专业能力。其专注于科研样品检测服务，能通过无菌验证、成分分析、活性评估，为研究生提供精准的血清品质报告，助力聚焦课题核心研究，减少试剂问题对科研进度的干扰。

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