四院院士谭蔚泓教授，2026年，首篇Science！

细胞表面蛋白是临床上重要的作用靶点，在细胞通讯、信号传导和稳态维持中起着关键作用。然而，目前针对这些靶点生成高亲和力分子探针（如核酸适体）的方法仍然有限。传统方法通量低，且常在筛选过程中破坏蛋白质的天然构象，导致大量靶点未被充分探索，从而阻碍了基于适体的诊断与治疗开发。

鉴于此，中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士、吴芩研究员等开发了一种名为SPARK-seq（单细胞扰动驱动的适体识别与动力学测序）的高通量平台。该平台将CRISPR基因扰动与单细胞转录组及适体测序相结合，可在天然细胞环境中高效、系统地绘制适体‑靶标相互作用图谱。通过一次实验，SPARK-seq成功将5535种不同的适体映射到8个表面蛋白上，覆盖了超过两个数量级的蛋白丰度范围，并能够区分高度同源的旁系同源蛋白。该平台还可提供动力学信息，优先筛选出解离速率慢的适体，并借助深度学习框架SPARTA进行适体预测与变体生成，为精准诊断与治疗提供了强大的分子工具开发平台。相关研究成果以题为“SPARK-seq: A high-throughput platform for aptamer discovery and kinetic profiling”发表在最新一期《science》上，罗国焰、宋佳为论文共同第一作者。

【SPARK-seq工作流程】

SPARK-seq整合了多重CRISPR介导的基因敲除与单细胞RNA测序。首先，研究人员设计了一个与单细胞测序兼容的适体文库，其核心为46个随机核苷酸区域，两端分别带有32 nt的5’ PCR手柄和22 nt的3’捕获序列（图1A）。经过四轮Cell-SELEX筛选，获得了与靶细胞特异性结合的富集适体文库（图1B）。随后，该文库与经过CRISPR敲除不同表面蛋白的混合细胞群共同孵育，并进行10X Genomics 5’端测序。在此检测中，gRNA、适体和mRNA分别通过CRISPR捕获引物、模板转换寡核苷酸（TSO）和poly(T)序列被捕获（图1C）。测序后，通过识别和校正每个组学层的细胞条形码，将每个细胞及其对应的扰动与适体结合谱关联起来（图1D，图1E）。

图 1. SPARK-seq 工作流程概述

【概念验证】

为验证SPARK-seq能否有效建立基因敲除、细胞表型与适体结合之间的直接关联，研究团队以蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）为靶点进行了概念验证。使用PTK7特异性适体sgc8c，在人和小鼠细胞系中进行了CRISPR敲除。Western blot和流式细胞术证实PTK7敲除细胞中PTK7表达及sgc8c结合均显著下降（图2A，图2B）。经过序列修饰的sgc8c-S在SPARK-seq中同时分析了PTK7 gRNA、mRNA和适体结合信号（图2C）。单细胞转录组UMAP图谱清晰区分了人和小鼠细胞（图2D），而sgc8c-S结合谱显示，不含PTK7 gRNA的细胞结合信号高，表达PTK7 gRNA的细胞结合信号显著降低（图2E-图2G），证实了SPARK-seq在单细胞水平关联遗传扰动与适体结合的能力。

图 2. SPARK-seq 与 SGC8c 适体的概念验证

【SPARK-seq绘制适体‑靶标相互作用图谱】

为探索SPARK-seq能否对混合遗传扰动细胞群实现高通量适体靶标识别，研究人员对SUM159PT细胞进行了四轮Cell-SELEX筛选，获得了富集文库R4（图1B）。通过pull-down联合质谱分析筛选回合中的潜在靶标，最终选择了13个膜蛋白进行CRISPR扰动（每个蛋白3个不同的gRNA）。将混合扰动细胞群与R4文库孵育后进行SPARK-seq分析。经过数据质控，最终保留了8466个高质量单细胞，涉及34个不同的gRNA表达群体。对适体序列进行分析，从4.027×10⁷个独特序列中选取了占总读数68.84%的前10,000个序列进行下游分析。通过BLAST和马尔可夫聚类（MCL）算法将这些序列归类为1906个适体家族（图3A，图3B）。SPARTA算法通过结合结合差异计算、质量控制与评分系统，最终成功识别出12个适体家族与9个不同扰动细胞群之间的特异性结合差异（图3C-图3F）。例如，家族5、13、17靶向CDCPI；家族3靶向ITGA3/ITGB1；家族2、6、7靶向NRP1等（图3G）。

图 3. 高通量适配体-靶点定位流程

【适体‑靶标相互作用的验证】

为验证SPARK-seq/SPARTA预测的相互作用，研究人员通过流式细胞术、表面等离子体共振（SPR）和微量热泳动（MST）等多种正交方法进行了确认。以PTK7靶向适体为例，Apt-1-1和Apt-15-27均能特异性结合表达PTK7的细胞，而在PTK7敲除细胞中结合丧失（图4B）。SPR和MST测定证实其对PTK7蛋白具有纳摩尔级的亲和力（图4C）。类似地，针对CDCPI、NRP1、NRP2等靶点的适体也通过了验证（图4D-图4I，图4Y）。研究还发现了多靶点结合的适体，如家族3的Apt-3-3同时需要ITGA3和ITGB1才能结合（图4N，图4O），家族4的Apt-4-5能同时结合PTPRD、PTPRF和PTPRS三个高度同源的蛋白（图4Q，图4T，图4W，图4R，图4U，图4X）。最终，SPARK-seq成功绘制了5535个适体序列与8个表面蛋白（PTK7、ITGA3、CDCPI、NRP1、NRP2、PTPRD、PTPRF、PTPRS）之间的相互作用图谱（图4Z）。

图 4. 适配体靶点验证

【适体特异性的正交验证】

通过流式竞争实验、生物素化适体pull-down结合免疫印迹以及SPR交叉结合实验等多层次验证，证实了SPARK-seq衍生适体具有高度的分子特异性（图5A，图5B）。例如，尽管NRP1和NRP2结构高度相似（图5C），但SPARK-seq鉴定出了分别特异性结合NRP1或NRP2且无交叉反应的适体（图5D）。NRP1适体能竞争性阻断VEGF165的结合，而NRP2适体则结合在一个不干扰VEGF165、VEGF-C或TGF-β1结合的非经典位点上（图5E，图5F）。验证的8个靶标在等电点、疏水性、结构域组成和细胞表面表达丰度上呈现广泛差异（图5G），表明SPARK-seq能够发现针对表达量跨越两个数量级以上、具有不同理化特性的细胞表面蛋白的适体，其基于单细胞差异筛选的策略相比传统方法更能发现如CDCPI等可能被常规生化技术遗漏的靶标。

图 5. 适配体特异性验证

【SPARK-seq优先筛选慢解离速率适体】

研究发现，SPARK-seq的富集偏好与适体的解离速率（koff）强相关，而非平衡亲和力（KD）。对于靶向PTK7的适体，其结合差异（‑log₂FC）与koff在流式细胞术、SPR和实时相互作用细胞术（RT‑IC）中均显示出强相关性（R²分别为0.84、0.88、0.87），而与KD相关性弱（图6A-图6F）。这一规律在其他靶点如CDCPI、NRP1、NRP2、PTPRF中也得到证实（图6G-图6J）。与传统筛选方法倾向于选择拷贝数最高的适体不同，SPARK-seq筛选出的具有最高‑log₂FC值的适体通常具有显著更慢的解离速率（图6K-图6P），这对于需要长时间靶标占据的治疗和诊断应用至关重要。

图 6. 鉴定具有明显解离动力学的适配体

【总结与展望】

SPARK-seq通过整合CRISPR基因扰动、单细胞转录组与适体测序，建立了一个能够在天然细胞环境中高通量、高特异性鉴定适体‑靶标相互作用并解析其动力学的强大平台。它不仅克服了传统方法对高丰度蛋白的偏好和PCR偏倚，还能有效区分同源蛋白并优先筛选具有慢解离特性的适体，为开发更优的诊断和治疗性适体提供了新范式。未来，通过使用化学修饰文库、更高通量的平台、优化的CRISPR策略以及竞争性筛选，SPARK-seq有望进一步扩展其应用范围，例如通过基因组规模的CRISPR筛选系统绘制适体与未知表面蛋白的相互作用图谱，或通过细胞透化技术探索细胞内靶点，从而推动“适体组学”发展和精准医学的进步。