FSHW | 转录组学和蛋白质组学分析揭示了紫陀螺菌菌丝发育过程中的碳代谢特征

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Introduction

紫陀螺菌（Gomphus purpuraceus（Iwade）Yokoyama）是一种食用历史悠久的区域性珍稀野生菌，因肉质脆嫩、滋味鲜美、不易腐烂等特点而备受消费者喜爱。但由于生态位的不确定，紫陀螺菌仍未实现人工驯化栽培。

根据紫陀螺菌的野外生长环境调查和菌根检查结果，紫陀螺菌被认为是一种外生菌根性真菌。进一步通过对紫陀螺菌进行全基因组注释和比较基因组分析发现，紫陀螺菌与外生菌根性真菌显示出类似的CAZymes数量和分布。通过CAZymes的进一步分析发现，紫陀螺菌基因组中有许多编码木质纤维素降解酶和淀粉酶的基因，这说明紫陀螺菌也有潜在利用木质纤维素和淀粉的能力。因此，解析紫陀螺菌的碳源代谢特征对其菌种繁育和资源开发利用具有重要意义。

贵州省林业科学研究院耿阳阳副研究员、贵州大学酿酒与食品工程学院秦礼康教授等以贵州特色野生紫陀螺菌为研究对象，利用转录组结合蛋白组技术对4种培养基中的紫陀螺菌进行研究，并进一步通过培养基形态和相关酶活特性来探究紫陀螺菌的最佳碳源。

Results and Discussion

不同培养基中碳水化合物酶的DEGs和DEPs

碳水化合物活性酶家族（CAZymes）参与碳水化合物的合成、代谢和转运，包括糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）、多糖裂解酶（PLs）、碳水化合物酯酶（CEs）、辅助活性（AAs）和碳水化合物结合模块（CBMs）。紫陀螺菌在四个培养基中的转录本和蛋白质被注释在CAZy数据库中。所有样本共有402个转录本和168个蛋白质注释到CAZy数据库。

在A vs B比较组中，总共有100个DEGs和19个DEPs，其中42个DEGs上调和6个DEPs上调。在补充葡萄糖后（B vs D组），发现有124个DEGs（53个上调，71个下调）和23个DEPs（15个上调，8个下调）。尽管在培养基C中含有新鲜马铃薯，但蛋白胨的缺乏导致了DEGs和DEPs的下调数量大于DEGs和DEPs的上调数量，特别是GHs和CBMs（A vs C比较组）。这个结果表明蛋白胨中的某些氨基酸是合成碳水化合物酶所必需的。在C vs D组中，补充蛋白胨后，与CAZymes相关的上调DEGs和DEPs数量略有增加。在富含葡萄糖和蛋白胨的培养基中加入新鲜马铃薯汁（A vs D组），能够促进GH5、GH28、GH31、GH92、GH92、AA2、AA3、AA5、AA6、CE8、CE10和CBM13相关基因的表达。然而蛋白组数据显示仅有AA2、GH55和GT90中的家族蛋白被上调。

图1 不同培养基中碳水化合物酶的DEGs和DEPs

紫陀螺菌中木质纤维素降解相关基因分布

纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木质素氧化酶家族与木质纤维素的降解密切相关。为进一步了解紫陀螺菌的木质纤维素降解能力，本研究特别注释了紫陀螺菌中涉及木质纤维素降解的有关基因。在12个样本中，紫陀螺菌中共注释了61个参与木质纤维素分解的表达基因。涉及纤维素酶的表达基因有19个，主要包括内切葡聚糖酶、1,4-β-纤维素生物糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。然而，在蛋白质组数据中仅注释到5种与纤维素酶相关的蛋白质。对于半纤维素的降解，紫陀螺菌转录组数据中寻找出了8个表达基因，而在蛋白质组数据中仅鉴定出2个阿魏酸酯酶。对于果胶的降解，紫陀螺菌中的果胶酶有果胶裂解酶（2个转录本）和聚半乳糖醛酸酶（3个转录本）。从表达水平角度分析，在培养基中加入马铃薯可显著促进编码果胶裂解酶基因（EVM0006180）的表达。木质素是植物生物量的主要成分之一。木质素的降解主要依赖于含漆酶的多铜氧化酶、锰过氧化物酶（MnP）、木质素过氧化物酶（LiPs）和其他过氧化物酶等氧化酶。在12份样品中共鉴定出22个表达基因，编码13种多铜氧化酶（10种漆酶）和9种锰过氧化物酶。然而未发现编码木质素过氧化物酶（lignin peroxidase）的基因。在这些木质素氧化酶基因中，包括多铜氧化酶和锰过氧化物酶在内的所有样品中表达量最高的基因是EVM0008356（FPKM A-D: 578.59、100.68、50.34、77.12）。然而，在蛋白质组数据中只检测到一种与铁多铜氧化酶相关的蛋白质。EVM0004142编码的多铜氧化酶是木质素氧化酶家族中唯一检测到的蛋白。最后，在木质素降解辅助酶家族（葡萄糖氧化酶、酒精氧化酶、吡喃糖氧化酶、香草醇氧化酶、乙二醛氧化酶、半乳糖氧化酶、苯醌还原酶）中，仅检测到1个与酒精氧化酶相关的编码基因和6个与半乳糖氧化酶相关的编码基因。

考虑到蛋白质组数据中注释为木质纤维素酶的蛋白质很少，典型的木质纤维素降解酶活性应该被进一步分析，如α/β-淀粉酶、内/外-1,4-β-葡聚糖酶、锰过氧化物酶、漆酶和果胶酶等。

紫陀螺菌潜在碳源代谢特征

为深入了解紫陀螺菌的营养代谢途径，评估其人工栽培潜力。本试验集中研究了在不同培养基上培养的紫陀螺菌的DEGs和DEPs，特别是那些参与木质纤维素降解的DEGs和DEPs。结果表明，糖酵解/糖异生（ko00010）、丙酮酸代谢（ko00620）、乙醛酸和二甲羧酸代谢（ko00630）和TCA循环（ko00020）是主要的供能途径。如果单糖（葡萄糖等）或寡糖（麦芽糖、蔗糖等）不足，多糖（淀粉、纤维素、果胶等）、氨基酸（色氨酸、苏氨酸、酪氨酸等）和脂肪酸将是主要的碳源。在自然界中，降解多糖（淀粉、木质纤维素等）的能力对真菌是十分重要的。淀粉是真菌在自然界中的重要碳源来源，一些外生菌根性真菌，如牛肝菌、乳菇等，显示了利用淀粉作为生长基质的能力。在本研究中，紫陀螺菌在葡萄糖缺失的情况下，淀粉和蔗糖代谢途径中有6个上调基因和4个下调基因。尽管如此，紫陀螺菌大部分的DEGs都呈现下调趋势，尤其是在与能量供应有关的TCA循环和与发育有关的蛋白酶体中。紫陀螺菌在B vs D比较组的转录调控表明淀粉不能成为紫陀螺菌生长发育的主要碳源。紫陀螺菌对木质纤维素的降解也是本研究的焦点之一。首先，由内切葡聚糖酶、1,4-β-纤维二糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的纤维素酶主要降解植物中的纤维素。紫陀螺菌中19个相关基因的转录表达说明其可能具有一定降解纤维素的能力，特别是1,4-β-纤维二糖苷酶的存在，它可以特异性地水解1,4-β-D-糖苷键。对这些编码纤维素酶的转录本进行分析，B vs D组中有6个基因下调，表明充足的葡萄糖降低了紫陀螺菌对纤维素的利用。对半纤维素的降解，内切-1,4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-L-阿拉伯糠醛苷酶等一系列酶扮演重要角色。然而，紫陀螺菌中仅发现8个编码半纤维素酶的基因，包括1个编码内切-1,4-β-木聚糖酶、6个编码阿魏酸酯酶、1个编码α-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。与腐生真菌相比，紫陀螺菌中缺乏腐生真菌中常见的几种关键酶，如β-木糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶等。而且半纤维素酶的低表达暗示紫陀螺菌可能难以从半纤维素中获得碳源。紫陀螺菌中果胶酶种类和数量的分布也表明其对果胶具有有限的降解能力。与外生菌根真菌相似，紫陀螺菌中含有丰富的多铜氧化酶和锰过氧化物酶。然而编码多铜氧化酶的基因数量与真菌生态位并不一致，因为它们广泛存在于所有真菌中。况且在植物细胞壁组分木质素的生物降解中起着核心作用的木质素过氧化物酶的编码基因并未被发现，这表明紫陀螺菌对木质素的降解也很有限。

图2 无外源添加条件下紫陀螺菌可能的碳源获取途径

Conclusion

本研究采用转录组和蛋白组技术联合分析了四种培养基中紫陀螺菌菌丝生长期间的DEGs和DEPs表达情况。在缺乏葡萄糖的情况下，紫陀螺菌中涉及氨基酸（Try、Thr、Tyr、Gly、Ser、Arg、Pro、Val、Leu等）、淀粉、纤维素、木质素、半纤维素、果胶以及部分脂肪酸降解的基因都转录表达，并在12个样本中注释出61个木质纤维素降解表达基因，但DEGs和DEPs的差异富集暗示紫陀螺菌对淀粉、纤维素等大分子碳水化合物的降解有限。在蛋白胨缺乏的情况下，部分氨基酸（Ala、Phe、Arg、Pro、Try、Tyr等）代谢路径中的相关基因表达下调，表明这些氨基酸可能是紫陀螺菌生长发育所必需。在添加了鲜马铃薯汁后，紫陀螺菌的DEGs和DEPs富集分析表明其生长需要一定的生长因子（growth factor），尤其是维生素（硫胺素、核黄素和维生素B6）和碱基（嘌呤、嘧啶）等。

01

第一作者

耿阳阳，男，理学博士，现为贵州省林业科学研究院副研究员，主要从事森林资源食品开发利用研究与应用。工作以来，主持省科技厅、省林业局等各类科研项目5项，参与国家林草局、省科技厅、省林业局项目多项。以第一作者身份在中文核心及以上期刊发表文章10余篇，其中SCI收录5篇，授权国家发明专利1项、实用新型专利1项。

02

通信作者

秦礼康，酿酒与食品工程学院副院长、教授、博士、博士生导师、学术学科带头人，兼任教育部食品科学与工程类专业教指委委员、省食安委委员、省法院知识产权审判咨询专家等。主要从事特色油料高品质制油及新产品延伸技术、优势杂粮杂豆主食化及高值化精深加工技术、特色发酵食品品质提升及新产品开发技术、营养健康全谷物主食化新产品加工及保质技术、食品安全控制及风险评估等科研工作。先后主持国家、省、市各类课题及企业横向项目80余项，经费2000多万元，近五年发表学术论文70余篇（其中SCI收录30余篇），授权国家发明专利10件，主编教材2部，专著2部。获省科技进步二等奖1项，三等奖1项。研究方向:主要从事杂粮杂豆营养保健功能与新产品开发、淀粉植物和大宗粮油副产物及木本油料深加工增值与废弃物处理、传统特色发酵食品挖掘与工业化“瓶颈”关键技术研发、食品安全控制体系构建以及风险评估等粮油科学与工程领域方面的研究。

Transcriptome and proteome analysis reveals the characteristics of carbon metabolism in the mycelial development of Gomphus purpuraceus

Yangyang Genga,b,c, Shixin Zhangb,c, Yana Liub,c, Likang Qind,e,*

a Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region, Ministry of Education, College of Life Sciences/Institute of Agro-Bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China

b Guizhou Institute of Walnut, Guiyang 550025, China

c Guizhou Academy of Forestry, Guiyang 550025, China

d School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China

e Guizhou Industrial Technology Research Institute of Rare Edible and Medicinal Fungi Co., Ltd., Guiyang 550025, China

*Corresponding author.

Abstract

Gomphus purpuraceus is an ancient wild edible mushroom. However, the niche and lignocellulose degradation system of G. purpuraceus have remained cryptic. In the current study, transcriptome and proteome sequencing of G. purpuraceus in four mediums was performed. A total of 3489 differentially expressed genes (DEGs) and 891 differentially expressed proteins (DEPs) were screened out. For the lignocellulose degradation system, a total of 61 expressed genes were annotated, including 19 genes encoding cellulase, 8 genes encoding hemicellulase, 5 genes encoding pectinase, 22 genes encoding lignin oxidase, and 7 lignin degrading auxiliary enzyme. From two-omics, morphology, and enzyme activities, we speculated that G. purpuraceus might have a limited capacity to degrade polysaccharides (starch and lignocellulose). In addition, trace amount of fumonisins (FB1 and FB2) were found in the G. purpuraceus. These results provided a new perspective for understanding the key pathways and hub genes involved in carbon metabolism of G. purpuraceus development.

Reference:

GENG Y Y, ZHANG S X, LIU Y N, et al. Transcriptome and proteome analysis reveals the characteristics of carbon metabolism in the mycelial development of

Gomphus purpuraceus

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编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意