什么是活细胞成像？

　　图1：动态活细胞与静态固定细胞。答：活细胞具有社会性，通常彼此靠近生长，交换化学信息，并不断在动态系统中移动。B. 固定单元是静态的时间快照。首先，细胞被洗涤，然后用固定剂(黄色，如甲醛)处理，接着用对比剂(抗体、染料、钙指示剂等，红绿方块表示)孵育，这些标记物可以包围或进入细胞(因为在此过程中细胞膜被破开)。细胞随后被夹在玻璃之间并密封，以避免固定剂蒸发。

　　介绍

　　大量生命科学研究涉及各种细胞/组织的成像。成像细胞和组织时主要有两种范式：固定细胞和活细胞。

　　活着 vs 固定

　　“固定”细胞是指被保存得尽可能接近“真实”状态的细胞。细胞在此过程中死亡，但其形状和内容物大多保留用于成像，且在固定细胞上进行后续制备步骤比活细胞更容易。不幸的是，化学和物理固定过程(如在甲醛中保存)会不可逆地改变细胞的组成和外观，但大致的模式、网络、蛋白质和DNA可以较大地保持。细胞在固定过程中也可能被打开，这使得抗体和化学物质能进入细胞，从而更容易成像。

　　我们今天看到的大量细胞图像来自于玻璃培养后，经过固定、准备/染色，最后夹在盖片之间并密封的细胞，如图1所示。这使得这些细胞可以在相同条件下被成像数月甚至数年，基本上将细胞冻结在时间中，从而实现详细分析。然而，这些图像并不能代表活体系统中的细胞行为和特征，而活体系统更具有生物学意义的数据。

　　图1：动态活细胞与静态固定细胞。答：活细胞具有社会性，通常彼此靠近生长，交换化学信息，并不断在动态系统中移动。B. 固定单元是静态的时间快照。首先，细胞被洗涤，然后用固定剂(黄色，如甲醛)处理，接着用对比剂(抗体、染料、钙指示剂等，红绿方块表示)孵育，这些标记物可以包围或进入细胞(因为在此过程中细胞膜被破开)。细胞随后被夹在玻璃之间并密封，以避免固定剂蒸发。

　　活细胞成像顾名思义，细胞在活体时被成像，通常是在培养基中。与代表永不变化的静态单元不同，活性单元代表了随时间移动和变化的动态单元。这意味着影像随时间变化(称为“延时摄影”)对活细胞成像非常重要。然而，对细胞或组织等复杂三维物体进行长期成像，会产生四维影像和一系列新的问题。一个主要问题是对比剂和染色。

　　细胞及其内部较小结构大多是水，因此是透明的。在玻璃或透明塑料背景上拍摄这些水袋时，图像信息不多，因此必须有某种对比剂或染料/染色剂，以显示所有细胞成分。对于固定细胞，你可以直接添加染色剂，因为这些细胞已经死去固定，不会受到影响。对于活细胞来说，存在毒性问题，染色活细胞通常会导致细胞死亡。

　　由于染色问题，大多数活细胞成像采用明场技术，仅用光照亮可观察到的微弱光源。直到20世纪40年代相差显微镜的发明，活细胞成像才真正起飞，因为能够在不使用对比剂/染色剂的情况下更好地观察活细胞。

　　相差显微镜

　　当光通过高密度介质(水、油、玻璃等)时，速度会减慢。离开高密度介质后，光的相位略有偏移，相位相位略微偏移，而光线则没有穿过任何密集物质。这被称为相位偏移。如果相位偏移的光与正常光相遇，它们几乎会相互抵消(相消干涉)，导致相交点的光强度大幅降低。

　　相位对比显微镜利用相位偏移来改变光的强度。样品被穿过光阑的光照射，形成光环。这个光环穿过样品(比周围空气密度高)，并且发生相位偏移，光线根据样品部分的厚度不同，向不同方向折射。大多数生物样本厚度不均，会导致各种不同的折射。这种折射的相位移光穿过由内外部分组成的相位环。如果折射光穿过环的外层，则会进一步相位偏移，呈现为暗光。 如果折射光穿过环的内侧，它看起来很亮。通过这种方式，细胞的不同部分根据厚度呈现明亮或暗淡，从而在图像中获得更好的对比度。这种相较于明场的改进可见于图2。

　　相机技术、像素密度和灵敏度的进步推动了相位对比的进步以及定量相位对比的发展。使用定量相差技术拍摄的图像可以自动处理，随时间从动态单元中提取大量信息。只需一次曝光，图像还可在不同焦平面拍摄，从而实现更好的三维成像，尤其是在旋转扫描下，能够随时间拍摄活细胞的高分辨率三维图像。这些进步使活细胞成像能够得到更精确的分析。

　　图2： 相位对比显微镜与明场显微镜。最上排是明场图像，左侧是显微镜孔径。底排是相同样品的相位对比图像，左侧配有晕显微镜孔径。这些透明样品在明场下难以成像，但在相差成像中，信息量增加则更加清晰。

　　活荧光显微镜

　　如果由于毒性问题无法用荧光染料染色活细胞，那么活细胞能否用荧光显微镜成像?相位对比无法像荧光显微镜那样观察特定蛋白质和细胞组分，限制了可进行的实验范围。

　　解决方案是荧光蛋白(FPs)。其中最著名的是绿色荧光蛋白(GFP)，在另一篇题为《什么是GFP?》的短文中详细介绍了它。多种不同颜色的FP使得现场荧光实验的深度和定制性堪比固定细胞荧光成像。通过将GFP基因直接插入细胞基因组，遗传编码的FP允许在每次成像中将非侵入性的荧光标记附着在任何蛋白质或细胞组分上，即使跨越多代，因为FP通常具有遗传性。图3中可以看到多FP的实时荧光成像。

　　虽然荧光活成像最初还不确定，但随着荧光标记的引入，对带有荧光标记的细胞进行详细的延时成像变得可行且简单，开拓了活细胞成像的领域。

　　图3： 对海胆胚胎进行实时荧光延时成像，细胞核被青色荧光蛋白(CFP)染色，细胞核被黄色荧光蛋白(YFP)染色。每张图片都显示时间戳(以毫米：秒为单位)。这些细胞被描绘成分裂，细胞的遗传物质被拉成两块相同的部分，准备分裂。图像采用激光扫描共焦点显微镜拍摄。

　　活细胞成像用相机

　　在选择科学相机进行检测时，所需因素会根据样品需求而高度变化。如果样品移动不快且需要长时间曝光以实现延时，CCD是不错的选择;但如果样品运动速度快(如细胞器)、低光环境且曝光时间较短，研究人员通常使用背光式sCMOS相机。鉴于探测器种类繁多，确保相机的分辨率、灵敏度、速度和视野与应用相匹配。

　　总结

　　总体而言，活细胞成像是固定细胞成像的有力替代方案，随着定量相位对比和活荧光等技术的进步，越来越多的研究人员开始进行细胞实时成像，以获得最具生物学意义的数据。