动物行为实验指南丨啮齿动物口面部疼痛评估方法总结

口面部疼痛评估装置（OPAD）是一种基于自愿行为的操作性疼痛评估系统。OPAD系统由一个热刺激器和金属丝组成，可用于评估热敏感性和机械敏感性。处于饥饿状态的实验对象被放置在操作箱内，只有当它接触热刺激和机械刺激时，才能获取食物奖励。从本质上讲，实验对象需要选择忍受刺激以获得奖励。与传统的通常基于反射行为的检测不同，OPAD允许实验对象为获得奖励自行选择刺激阈值。这种奖励-冲突范式在表面效度、内容效度和预测效度方面表现更佳。最初的操作性疼痛评估装置仅设计用于评估热敏感性。该装置包括一对热刺激器，它们由接地的铝管构成，排列在通往奖励喂食器的开口处。通过柔性聚乙烯管将加热或冷却到所需刺激温度的水输送过来，从而诱导热刺激。

基本组成和原理：

OPAD装置的热刺激器主要由能够产生和调节热量的部件构成。其工作原理是基于热传导，通过特定的加热元件（如加热丝等）将电能转化为热能。当开启热刺激功能时，加热元件会升温，热量会传递到与动物（如实验大鼠等）接触的部分。

热刺激器通常可以精确控制温度的变化，这是因为它配备了温度传感器和反馈调节系统。温度传感器能够实时监测热刺激器表面的温度，然后将温度信号反馈给控制器。控制器根据预设的温度程序和反馈的温度信息，调整加热元件的功率，以确保温度保持在设定的范围内。例如，如果预设温度为40℃，当温度传感器检测到温度低于40℃时，控制器会增加加热元件的功率，使温度上升；当温度高于40℃时，则会降低功率，使温度下降。

仪器与设备：

OPAD由一个带有金属底座的透明丙烯酸笼子组成。笼子底部有一个额外的金属格栅。在笼子的一侧，通往奖励喂食器的开口处排列着一对热刺激器和镍钛合金丝，分别对口面部区域提供热刺激和机械刺激。热刺激器之间的距离可以改变，以适应动物的大小。此外，温度（4°C至75°C的温度范围）和装置的实验参数可以使用相关软件和液晶显示屏进行控制和管理。该仪器配备了一个带有金属喷嘴的奖励瓶。只有同时接触热刺激器或机械突出物才能获得奖励。该设备允许自动记录数据。

实验中的应用方式：

在使用OPAD进行实验时，热刺激器会与动物的口面部等部位接触。动物被放置在操作箱内，由于饥饿驱动它去获取食物奖励。为了得到奖励，动物需要接触热刺激。热刺激器的温度可以根据实验目的进行调整。例如，在研究不同程度热刺激引起的疼痛反应时，可以设置一系列不同的温度梯度，如从35℃（接近正常体温，作为对照温度）逐步升高到50℃。当热刺激器温度升高时，动物接触热刺激所感受到的疼痛程度可能会相应增加。动物会根据自身对疼痛的耐受程度来选择是否继续接触热刺激以获取食物奖励。这种自主选择行为能够帮助研究人员了解动物对热刺激疼痛的感知和反应阈值。

实验过程中，热刺激器的工作时间也可以进行控制。可以设置单次热刺激的持续时间，比如每次热刺激持续5秒，然后间隔一段时间（如10秒）后再次进行热刺激。通过观察动物在不同热刺激时间下的反应，研究人员可以进一步分析动物对热刺激疼痛的时间-反应关系。例如，随着热刺激时间的延长，动物可能会更快地停止接触热刺激以避免疼痛。

研究表明，在42°C和45°C时，能够观察到辣椒素诱导的显著的异常性疼痛和痛觉过敏效应。另一项研究使用OPAD来研究雄性和雌性大鼠的冷敏感性。当在24°C、10°C和2°C的冰点以上温度对实验对象进行评估时，可以观察到雄性和雌性在行为表现上的差异。

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训练方案：

在每次使用前后以及不同实验对象之间，都要彻底清洁口面部疼痛评估装置。适当地照亮实验场地。确保将不必要的外部刺激降至最低。除了OPAD系统的数据采集外，还可以使用跟踪和视频系统。

预训练：

在OPAD中训练之前，将实验对象禁食适当的时间。将实验对象放入笼子中，并将热刺激器设置为非厌恶温度。给实验对象足够的时间探索仪器。每周至少进行3次试验，持续2周，或者直到观察到一致的行为。

操作性程序最适用于无毛啮齿动物。如果啮齿动物有面部毛发，强烈建议使用适当的方法去除。确保只去除颊部毛发，而不是触须垫/胡须，以免影响实验对象的行为。在测试前1至2天进行毛发去除程序，以获得准确的结果。在测试前进行处理。

在奖励瓶中装满奖励液体。将奖励瓶放在支架上，使实验对象必须用其颊部区域接触热刺激器才能舔到喷嘴。将实验对象放入笼子中。如果实验对象的触须碰到奖励瓶，或者颊部区域没有接触到热刺激器，则进一步调整奖励瓶的位置。将热刺激器设置为所需温度，并开始设定为预定试验长度的试验组。根据需要重复试验。

数据分析：

• 舔舐：舔舐次数、每次舔舐的持续时间、第一次舔舐的潜伏期、最长舔舐时间、最短舔舐时间、舔舐频率。

• 接触：接触次数、每次接触的持续时间、第一次接触的潜伏期、最长接触时间、最短接触时间。

• 比率：舔舐/面部接触比率（L/F：奖励舔舐事件数除以刺激接触次数。每次有舔舐事件时就会产生接触）是OPAD上痛觉感受的一个衡量指标。

口面部疼痛评估装置使用奖励-冲突范式来量化疼痛行为。这个简单的装置允许根据对温度以及机械刺激的反应来评估疼痛参数。因此，能够在单个系统内比较疼痛反应。该仪器允许比较治疗组与未治疗组的表现，以及不同疾病和损伤组的表现。

优点

操作性口面部评估装置允许在单个系统内评估机械性和热疼痛敏感性。该设置允许在相同的实验参数下直接比较两种模式下的表现。与传统的疼痛检测方法不同，OPAD依赖实验对象的自愿行为。此外，由于该装置不需要任何约束，对实验对象来说压力相对较小。

局限性

由于OPAD系统依赖自愿行为，训练和测试可能很耗时。该任务要求实验对象在训练前禁食。这给实验表现引入了一个食欲因素。热模拟在无毛皮肤上效果较好。因此，有毛发的实验对象在测试前必须去除毛发。成排的金属丝可能无法均匀地施加机械刺激。实验对象可能会通过倾斜头部来分散机械刺激的效果。实验对象的疼痛敏感性可能因其品系、年龄和性别而异。此外，嗅觉、听觉或视觉等外部因素会影响任务表现。

案例解析：

Fig1 为了接触装满甜炼乳的奖励瓶，动物必须接触一个由直径为0.010英寸的环形不锈钢丝组成的360°阵列。这种设计将因动物回避行为导致的误差降至最低（A）。当动物接触该阵列时（B），一个电机和螺纹杆会将奖励瓶组件移得离笼子更远（C）。动物必须持续让头部穿过机械刺激丝，才能获取奖励瓶。

实验流程概述

1. 测试前禁食及操作：动物在测试前禁食12-15小时（过夜）。次日早晨，将动物置于丙烯酸测试箱内。当动物接触奖励瓶时，控制并记录瓶子移动。重复该过程，直到收集到五次动物可耐受的奖励瓶距离测量值，或测试时间达到10分钟。每天为每只动物计算平均耐受距离。

2. 训练期

适应阶段：在两周时间内，每周三次让动物适应测试箱，期间动物可无障碍接触奖励瓶。

第三周：在水瓶前放置一个0.9英寸孔径的阵列，每周继续测试三次，奖励瓶的最大停止距离从0.0英寸增加到0.25英寸，最后增加到0.5英寸。

第四周：将孔径减小到0.7英寸，奖励瓶的最大停止距离再次从0.0英寸增加到0.25英寸，再到0.5英寸。

第五周：允许动物跟随奖励瓶至其最大耐受阈值。

3. 辣椒素诱导的口面部疼痛实验

辣椒素处理：训练后，用异氟烷麻醉动物，在覆盖咬肌直至触须的皮肤上大量涂抹辣椒素乳膏。用温水治疗垫对涂抹辣椒素的区域进行加热。5分钟后，用湿纸巾擦去多余的辣椒素，让动物在进行机械敏感性测试前恢复30分钟。

机械敏感性测试：在辣椒素测试前1周（基线）、第0天涂抹辣椒素（辣椒素）、第3天不涂抹辣椒素（基线）、第7天涂抹辣椒素（辣椒素）、第10天不涂抹辣椒素（基线）、第14天涂抹辣椒素（辣椒素）、第16天不涂抹辣椒素（基线）时，进行口面部机械敏感性测试。

文献引用：

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• Rossi HL, Neubert JK. Effects of environmental enrichment on thermal sensitivity in an operant orofacial pain assay. Behav Brain Res. 2008 Mar 5;187(2):478-82. doi: 10.1016/j.bbr.2007.09.021. Epub 2007 Sep 21. PMID: 17976833; PMCID: PMC2233846.

• Bowden LN, Rohrs EL, Omoto K, Durham PL, Holliday LS, Morris AD, Allen KD, Caudle RM, Neubert JK. Effects of cocoa-enriched diet on orofacial pain in a murine model. Orthod Craniofac Res. 2017 Jun;20 Suppl 1(Suppl 1):157-161. doi: 10.1111/ocr.12149. PMID: 28643911; PMCID: PMC5928773.

• Rohrs EL, Kloefkorn HE, Lakes EH, Jacobs BY, Neubert JK, Caudle RM, Allen KD. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. J Neurosci Methods. 2015 Jun 15;248:1-6. doi: 10.1016/j.jneumeth.2015.03.022. Epub 2015 Mar 28. PMID: 25823368; PMCID: PMC4417420.

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