藏药破解脑缺血难题：成都中医药大学解密25味药如何“瞄准”一个关键通路实现神经保护！

【写在前面】：本期推荐的是由成都中医药大学等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示通过大鼠实验证明，藏族药方二十五味珊瑚丸通过调节 GRP78/XBP1/CHOP 信号通路减轻内质网应激，从而缓解脑缺血损伤。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Ershiwuwei Shanhu pills alleviates cerebral ischemia injury in rats by regulating endoplasmic reticulum stress through GRP78/XBP1/CHOP pathway

背景

二十五味珊瑚丸（藏文名：བྱུ་དམར་ཉེར་ལྔ།，简称ESWWSHW）是一种用于治疗脑缺血的传统藏药复方，主要由25味药材组成，包括14种植物药和11种矿物药。该方剂于公元8世纪由玉妥·云登贡布创立，后被收录于藏医经典《四部医典》，并载入《中华人民共和国药典》（2020年版第一部）。其功效为开窍通络、止痛，临床上主要用于治疗“白脉病”（藏医病名，涵盖脑缺血）、神志不清、头痛、癫痫及各类神经性疼痛，然而其抵抗脑缺血损伤的具体分子机制至今仍未明确。

目的

本研究旨在系统阐明二十五味珊瑚丸抗脑缺血损伤的药效物质基础及其作用机制，特别是探索其是否通过调节内质网应激介导的细胞凋亡途径来发挥脑保护作用。

方法

研究首先采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）对二十五味珊瑚丸的化学成分及其入血成分进行定性分析，同时利用高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-QqQ-MS）对12批次样品的27种化学成分进行定量测定。在动物实验中，将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平阳性药组及二十五味珊瑚丸低、中、高剂量组，采用线栓法建立大脑中动脉阻塞（MCAO）脑缺血再灌注模型。药效学评价指标包括脑梗死比率和神经行为学评分。机制研究方面，综合运用代谢组学和蛋白芯片技术筛选差异代谢物与蛋白，并通过对脑组织（间脑、皮质、海马）进行病理学检查、TUNEL染色（检测凋亡）以及聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹（WB）和免疫荧光（IF）等分子生物学技术，验证药物对内质网应激-凋亡通路的影响。

结果

研究发现，从二十五味珊瑚丸中定性鉴定出76种化学成分，其中7种原型成分可入血，49种可分布至各组织（包括脑组织）。药效实验证实，该药能显著改善MCAO模型大鼠的神经行为学缺损，降低脑梗死率，减轻脑皮层和海马区的神经元病理损伤，并减少皮层凋亡细胞数量。机制上，代谢组学分析鉴定出14个差异代谢物，主要富集于鞘脂代谢和甘油磷脂代谢通路；蛋白芯片筛选出18个差异表达蛋白，网络分析提示IL-10、IL-3、IL-7可能是关键靶点。分子生物学检测进一步显示，二十五味珊瑚丸能显著上调缺血脑组织中ATF6、XBP1、BCL2的mRNA表达，下调CHOP、GRP78、BAX、NLRP3的蛋白表达，并上调XBP1蛋白表达，表明其核心作用与调控GRP78/XBP1/CHOP这一内质网应激信号通路密切相关。

结论

本研究表明，二十五味珊瑚丸对脑缺血损伤的保护作用，是通过调节鞘脂和甘油磷脂代谢、影响炎症相关因子（如IL-10、IL-3、IL-7），并最终通过抑制GRP78/XBP1/CHOP信号通路介导的内质网应激性细胞凋亡来实现的。该研究从现代科学角度揭示了这一传统藏药复方治疗脑缺血的作用机制。

【前言】

根据天文历法指导，藏医药师会依据时辰服用不同的藏药制剂，以达到更佳的治疗效果。例如，藏医治疗脑缺血疾病时，常联合使用“七十味珍珠丸或二十五味珍珠丸”与“二十五味珊瑚丸或珊瑚七十味丸”。通常，七十味珍珠丸在清晨6时左右服用，二十四味沉香丸在上午8时左右服用，如意珍宝丸在中午12时左右服用，二十味沉香丸则在晚上8时左右服用。根据患者其他症状，还会辅以其他适宜的藏药制剂。其中，二十五味珊瑚丸具有非常重要的地位。然而，我们课题组已对七十味珍珠丸开展了较多研究（Liang等，2019a，2019b，2023；Xu等，2020），并对二十五味珍珠丸进行了一些研究（Liang，2023a；Liang等，2024；Feng，2024）。尽管二十五味珊瑚丸在临床上常用于治疗脑梗死（Tan，2020；Zhu等，2020），但相关文献却不多见。目前，我们团队启动了对二十五味珊瑚丸的研究，旨在不仅阐明其作用机制与活性成分，也为后续揭示不同藏药配伍组合的科学性奠定基础。

【结果部分】

1.利用UPLC-Q-TOF-MS技术成功建立了二十五味珊瑚丸（ESWWSHW）及其混合对照品的正、负离子基峰离子流图，完成了制剂化学成分的定性分析基础。

2. 明确了ESWWSHW中76种已鉴定化学成分的可能裂解途径，为后续指认入血入脑成分提供了关键质谱信息。

3. 在大鼠脑缺血24小时后，鉴定出7种草药原型成分入血，49种成分进入各组织（包括5种入脑），提示这些成分可能是其治疗缺血性中风的潜在药效物质基础。

4. 对12批ESWWSHW中27种化学成分进行定量分析，发现藏红花素和羟基红花黄色素A的含量普遍较高，而乌头碱含量较低，且不同厂家的制剂存在成分差异。

5. 发现ESWWSHW能显著回调脑缺血大鼠血浆中14种差异代谢物（如半乳糖神经酰胺、1-磷酸鞘氨醇等），这些代谢物主要涉及鞘脂代谢和甘油磷脂代谢两条关键通路。

6.筛选出18个差异表达蛋白，并通过蛋白互作网络分析确定IL-10、IL-3和IL-7可能是ESWWSHW干预脑缺血损伤的关键炎症相关靶点。

7. 药效学实验证实，ESWWSHW能剂量依赖性地显著降低脑缺血再灌注模型大鼠的脑梗死率。

8.ESWWSHW能改善脑缺血皮层神经元的变性坏死，增加尼氏体数量，并显著抑制皮层细胞的凋亡。

9.在分子层面证实，ESWWSHW能上调脑组织中ATF6、XBP1、BCL2的mRNA表达，同时下调CHOP、GRP78、BAX、NLRP3的蛋白表达，并上调XBP1蛋白表达。

10.ESWWSHW通过调节GRP78/XBP1/CHOP信号通路介导的内质网应激与凋亡，是其发挥脑缺血保护作用的核心机制。

【结论与讨论】

综上所述，本研究的结论与讨论部分综合表明，二十五味珊瑚丸（ESWWSHW）通过多成分、多靶点、多通路的协同作用，对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。具体而言，研究首先通过UPLC-Q-TOF-MS和HPLC-QQQ-MS技术系统鉴定了ESWWSHW中的76种化学成分，并定量分析了12批次制剂中27种成分的含量，确认藏红花素和羟基红花黄色素A为主要成分；体内分析进一步揭示，在脑缺血模型大鼠中，有7种原型成分入血，49种成分进入各组织（包括5种入脑成分），提示这些成分可能是其发挥药效的物质基础。药效学实验证明ESWWSHW能显著改善神经行为评分、降低脑梗死率、减轻脑组织病理损伤并抑制细胞凋亡。机制研究发现，ESWWSHW能调节血浆中与鞘脂代谢和甘油磷脂代谢相关的14种差异代谢物，并通过蛋白芯片技术筛选出18个差异表达蛋白，其中IL-10、IL-3和IL-7被识别为关键炎症靶点；进一步的分子生物学验证表明，ESWWSHW通过调控内质网应激（ERS）介导的GRP78/XBP1/CHOP信号通路，上调ATF6、XBP1、BCL2等抗凋亡因子表达，同时下调CHOP、GRP78、BAX、NLRP3等促凋亡与促炎蛋白表达，从而抑制细胞凋亡与炎症反应，缓解脑缺血损伤。尽管研究存在一些局限性（如仅采用LC-MS分析非挥发性成分），但仍为ESWWSHW治疗脑缺血提供了系统的化学与药理学依据，并为其后续质量标准化、药代动力学及深入机制研究奠定了基础。

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