用于拉曼光谱的深耗CCD摄像机体内及医学诊断

　　体内拉曼光谱学

　　拉曼光谱是生命科学和生物技术中一项重要的测量技术，涵盖从分析单一生化分子结构的纳米级实验到疾病检测和组织性质监测。生命科学研究中的拉曼光谱学家在紫外(UV)到近红外(NIR)和短波红外(SWIR)区域使用激发和检测，激光激发波长的选择是平衡光谱分辨率、检测效率和避免自荧光背景的重要实验参数。

　　近年来，拉曼光谱在临床和体内光谱中的应用显著增长，因其在监测疾病、恶性组织检测、冠状动脉钙化和炎症方面的诊断潜力已被证明。拉曼光谱的一个显著优势是速度快且能够进行无标记测量。结果通常在几秒内即可获得，分子特异性极高，无需特殊样品制备或光学标记。

　　自发拉曼散射是一种弱效应，仅影响十分之一的现象6-108入射光子，需要能够探测极低信号水平的灵敏相机。不幸的是，生物组织上的应用往往无法通过增加激光功率来补偿，因为组织可能会被大量激光辐射损伤。因此，正确选择用于检测拉曼信号的相机对于体内拉曼测量至关重要。

　　近红外的高灵敏度

　　体内组织上的拉曼测量会受到自发荧光干扰的影响，这会遮蔽弱拉曼信号并使测量分析变得复杂。缓解自荧光的主要工具是选择更长的(近红外)激发激光波长，将拉曼信号转移到自荧光背景影响较小或消失的光谱区域。

　　最常用的激发选择是785nm或830nm激光，这两者同时伴随着组织中散射减少的窗口，从而实现更大的光学穿透深度。由于拉曼信号是作为相对于激光线的能量变化被检测到的，相关光谱信息将位于近红外波长范围内。

　　灵敏度检测的挑战在于，随着接近1100纳米的探测极限，基于硅的探测器在近红外的量子效率正在下降。此外，自发拉曼散射截面以1/λ的速率衰减。4与可见光激励相比，信号强度显著降低。鉴于这些挑战，正确选择检测系统对于体内拉曼光谱应用至关重要。

　　用于近红外波长区域的首选探测器是深度耗尽CCD，这是一种带有更高近红外灵敏度的背光传感器。其耗尽区宽度明显大于普通背光CCD，提高了在需要较长平均自由程以实现吸收和检测的红波段的效率。

　　最近，超深耗尽相机(有时称为HiRho CCD)发布，其近红外灵敏度更高。图1展示了深度耗尽“标准”CCD相机与超深度耗尽高近红外高灵敏度相机在波长增加下量子效率的比较。

　　图1：CCD相机在体内拉曼光谱学中的量子效率。条形图分别显示了785纳米(浅蓝色)和830纳米(橙色)拉曼光谱相关的光谱区域。绿色区域代表重要的指纹区域。

　　让我们来看看这种效率如何应用于785nm和830nm激发波长的拉曼光谱实验，特别是在拉曼信号可能出现的光谱带内。图1显示两条条，显示拉曼信号在785nm(蓝色条)和830nm(橙色条)激发下的光谱位置。指纹区域在500-1500厘米之间-1每个案例都用绿色高亮显示。它对应的波长为817-889nm(785nm激发)，865-948nm(830nm激发区)。

　　当需要进一步降低自体荧光背景时，830nm激光激发是一种选择，相较于785nm激发。然而，信号高波数区域的边缘(2500-3800cm)-1)部分位于硅CCD探测器探测范围之外的波长(硅CCD探测器无法探测波长超过1100纳米的光，这对应于> 2900厘米的830纳米激光的能量偏移-1).

　　InGaAs探测器可用于该波长范围的检测，但代价是噪声增加了几个数量级。事实上，对于自发荧光干扰最强的应用，有些实验甚至使用约1064nm的更高激发波长，以进一步将期望信号与干扰背景的光谱区域分离。

　　由于信号位于硅(Si)CCD无法探测的红外波长，因此应使用深冷却的InGaAs相机。使用液氮或先进热电冷却的深度冷却能有效减少热噪声，从而提升InGaAs相机的灵敏度。

　　从图1可以看出，标准的深耗摄像机以及更高近红外灵敏度的摄像机都非常适合高效检测拉曼信号的指纹区域。然而，后者为拉曼光谱中所有相关区域提供了更好的高灵敏度覆盖。

　　低噪声与深度冷却

　　弱信号要求光谱相机在低噪声水平下工作，尤其需要较低的读数和暗噪声。设计良好的相机电子设备会将读出噪声控制在最低水平。暗噪声是由每个像素中热产生的电荷以及传感器上入射光产生的电荷产生的。暗噪声还会在信号中引入偏置，随着曝光时间的延长而增加，从而增加信号中的噪声。

　　光谱相机通常通过垂直分组检测器排来作。分帧在读出前，在串行寄存器中收集列中每个像素(即所有对应相同波长的电荷)的电荷(因此读出噪声只累积一次)。然而，在分选过程中，列中每个像素的暗电荷也会累积。由于通常需要分组数十甚至数百个探测器行，暗电荷的有效积累量可能比相机数据手册中按像素计算的数值大出数量级。因此，用于体内拉曼光谱的灵敏相机应能在极低温度下工作，以避免传感器上积累暗电流。

　　在体内应用中，最常用热电冷却，以避免处理低温液体。最新一代深层热电冷却相机可在-75°C至-95°C之间，无需任何外部设备(如液冷循环或冷却器)。

　　除了热电冷却设计外，相机传感器腔体的良好真空对于实现低温也非常重要。吸尘器在运行时应无需维护，且寿命长，理想情况下应能贯穿相机的使用寿命。

　　低固定模式噪声与防折边技术

　　Etalon化是由传感器中光线干涉引起的。当检测到的波长大于700nm时，背光CCD相机中就会发生这种现象，因为探测材料(硅)在1100nm处接近检测极限时变得更透明。Etaloning会表现为传感器上一系列干涉条纹，在图像和光谱上都能看到。

　　对于体内拉曼光谱学，这些伊拉曼效应进一步复杂化了生物系统所显示的背景减法和数据分析。理想的体内拉曼光谱探测器需要减少或消除这些效应。

　　针对CCD相机传感器这些缺陷的传感器增强已被广泛应用，不仅可以消除无向化，还能扩大和提高传感器的光谱灵敏度。

　　例如，Teledyne Princeton Instruments eXcelon 工艺设计旨在消除 etalon(见图2)，并打造超宽带高灵敏度 CCD 摄像机。它显著提升了量子效率高达40%，量子电子流>从紫外到可见光的量子效率达到90%。eXcelon的设计还旨在为研究人员提供比单层或两层AR涂层更高的性能选择。

　　图2：使用eXcelon(右图)相较于标准背照CCD(左图)和两幅图像的截面，均改善了边缘化效果。用900nm单色光照明。

　　基于eXcelon技术的成功，专门为近红外拉曼应用，特别是体内拉曼光谱开发了一种名为eXcelon 4的新型CCD增强工艺。eXcelon 4在用785nm和830nm激光激发的拉曼测量中，从低波数和指纹区到高波数区，提供了理想的抑制。

　　探测器尺寸

　　体内拉曼测量通常使用光纤探针，探针以圆形或线性排列的纤维束。这种布置使光纤端部在信号收集侧形成密集排列，并沿光谱仪入口狭缝分布在光谱仪/探测器侧(见图3)。

　　图3：圆到线性纤维丛。输入和输出侧的特写视图。

　　这种配置增加了覆盖大面积光纤的信号收集，并优化了与光谱仪的耦合效率，同时可保持高光谱分辨率进行测量。(参见我们的技术说明：提升拉曼散射的收集效率)

　　图4展示了通过此类光纤束采样的原子发射灯光谱的色散图像。纤维在垂直方向上的线性排列清晰可见。

　　纤维丛的不同区域可能具有不同的光谱功能。例如，空间偏移拉曼光谱(SORS)利用组织侧纤维的空间排列，从地下组织区域获得深度依赖数据。

　　用于体内拉曼光谱的理想探测器应具备足够大的宽度和高度，以覆盖宽广的光谱范围且分辨率足够高，并且光纤束能够容纳大量光纤。光谱CCD如Teledyne、普林斯顿仪器的BLAZE和PIXIS摄像机系列，拥有宽27毫米和高8毫米的高传感器选项，尺寸足够容纳数十条高光谱分辨率的光纤线路。需要注意的是，这种探测器应与全焦平面像差低(如散光)的光谱仪配合使用。否则，光谱质量和分辨率将因像差的引入而降低。

　　图4：光谱学使用纤维束。光纤沿入口狭缝分布，提高了光耦合效率，同时保持高光谱分辨率。

　　摘要

　　用于体内诊断测量的拉曼光谱必须应对弱信号和大荧光背景辐射的挑战。由于深度耗尽和HiRho CCD相机在近红外中灵敏度高，是该应用的理想探测器。最新一代相机针对体内测量进行了优化，增加了以下特别硬件组件：

　　先进的热电冷却系统可达到低至-95°C的温度，无需冷却器或液体冷却剂

　　传感器增强以消除光谱数据中的无光化和边缘化现象

　　大型传感器以帮助最大化信号收集，并实现高光谱分辨率