Genome Biol | CAS9 切割不仅改序列，还改“记忆”：李墨团队发现 DNA 断裂重塑表观遗传状态

CRISPR-Cas9 引发的 DNA 双链断裂不仅改变遗传序列，还会扰乱局部表观遗传信息。

近日，Genome Biology在线发表了阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）李墨团队 题为CRISPR-Cas9-induced double-strand breaks disrupt maintenance of epigenetic information的 的重要研究，系统揭示：Cas9 诱导的双链断裂（double-strand break, DSB）会导致 DNA 甲基化维持失败，产生稳定且可遗传的表观遗传重塑。这一发现填补了基因编辑领域一项长期空白，并对未来临床基因治疗的安全性评估具有关键意义。

CRISPR–Cas9 通过制造精准的 DNA 双链断裂，实现靶向修复和基因编辑。过去的研究集中在 DSB 引发的序列层面突变，如插入、缺失和结构变异； 然而 DSB 是否会影响 DNA 的表观遗传状态，却一直缺乏直接证据 。

DNA 甲基化作为表观遗传的重要机制之一，是 维持 细胞身份、调控发育、保证基因组稳定性的重要方式。例如，印记基因的甲基化差异控制父源或母源等位基因的特异表达；而 CG 岛（ CGI ）超甲基化则是多种癌症的典型特征【1-5】。目前，大多数甲基化研究依赖亚 硫酸盐转化结合基因组 PCR 和短读长测序，无法同时观察天然 DNA 序列与其甲基化状态，也难以在单分子和单等位基因层面理解 DSB 对表观遗传的影响【6-8】。

在本研究中 ， 李墨团队借助纳米孔 （Oxford Nanopore） 长读长测序技术 ， 并结合团队改良的 Cas9-assisted targeted sequencing (CTS) 流程 ， 直接捕获细胞内 DSB 修复后的天然 DNA 分子 ， 实现了 单分子、单等位基因水平的序列 – 甲基化双层解析 。通过对多个基因组背景（H1 hESC 的印记 DMR、异染色质高甲基化区域，以及 RKO 细胞系的 MLH1 超甲基化区域）进行高覆盖度测序（≥242×），研究团队同时获得了断裂前后 DNA 序列变异与单碱基分辨率甲基化信息。结果显示，在印记基因（SNRPN、PEG10）、异染色质区域（UCA1、CRCT1）以及肿瘤相关基因（MLH1）等多个模型中，Cas9 切割均引起 局部 DNA 甲基化显著下降 。进一步分析发现，甲基化异常具有明显的单等位基因和单分子特异性，呈现出 Opposite 和 Mosaic 等典型模式，在切割组中远高于未切割对照。

机制研究指出，甲基化丢失可由三类事件驱动：① 同源重组导致的等位基因交换；② 大型结构变异引发的序列缺失【9-14】；③ 断裂修复过程中 DNA 甲基化维持失败 。令人意外的是，超过 80% 的异常甲基化读段并未伴随任何结构变异，提 示 第三类机制最为普遍，即 DSB 本身已足以破坏细胞对甲基化状态的忠实维护 。

更重要的是，研究团队在单细胞克隆中发现，这些由 DSB 导致的甲基化改变 可 在细胞世代间稳定遗传 ，表现为长期“表观遗传记忆”。此外，在未编辑样本中，团队通过识别自然产生的微缺失事件（≥2 bp），观察到缺失周围同样存在甲基化下降并随距离恢复的模式，进一步证 明 DSB 修复本身即是扰乱表观遗传环境的一般性机制，而非 Cas9 特有产物 。

该研究揭示的现象对基础生物学与医学转化均具有深远意义。DSB 不仅塑造 DNA 序列，还可能通过重写 DNA 甲基化影响基因表达、印记调控、细胞命运以及癌症表观遗传状态。随着基因编辑疗法（如近期获批的镰刀型贫血 CRISPR 疗法）进入临床， 表观遗传层面的安全性评估应成为未来关注重点 。

KAUST 李墨副教授 为该论文 通讯作者 。 KAUST 团队 还包括 王梦鸽博士 （共同 第一作者 ） 张樱子 博士 （共同 第一作者 ） ，毕重伟 博士（现 任 吉林大学 助理 教授 ， 共同作者 ） 。

https://link.springer.com/article/10.1186/s13059-025-03851-9

制版人：十一

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