FSHW | 负载番茄红素的铁蛋白纳米笼改善血脑屏障转运并缓解神经细胞衰老和凋亡

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Introduction

衰老是随着时间的推移不可避免的生理退化过程，伴随脑功能的下降，表现为氧化应激增加、神经元丢失、神经传导下降、记忆下降等。研究表明，活性氧（ROS）的过度产生触发细胞内过氧化反应和级联反应，是神经元退行性变微环境的主要驱动力。近年来，纳米材料设计策略已广泛用于退行性神经元的靶向干预。考虑到工程纳米复合物的生物相容性差、脑血比低、ROS清除不足、合成困难和尺寸大等一系列问题，迫切需要一种快速且可代谢的合成策略，用于脑蓄积和有效的ROS消除。

天然抗氧化药物在复杂发病机制的长期干预过程中可以提高患者的免疫力。其中，番茄红素（LYC）作为高效抑制单线态氧（1O2）的类胡萝卜素，可抑制氧化应激级联反应、神经元凋亡、神经炎症和线粒体损伤。然而，LYC的低生物利用度和血脑屏障的低通透性限制了其在神经元中的有效性，使合适的载体成为保护和丰富它的必要条件，以放大其在大脑中的功能。理想的纳米递送平台应具有较高的循环稳定性，便于将载药靶向递送到特定部位并以优异的生物相容性被神经元吸收。与此同时，得益于纳米颗粒的保护屏障和递送，亲脂性分子的水溶性和稳定性提高，使其对神经元更有效。

本研究以重组人H-铁蛋白纳米笼（rHuHF）为最佳载体构建天然抗氧化rHuHF-LYC纳米粒。通过异源表达获取rHuHF载体，将LYC分子装入rHuHF的稳定空腔内，通过分子模拟结合实验验证探究rHuHF与LYC的相互作用。通过BBB跨细胞模型、亚细胞荧光定位及rHuHF-LYC的抗氧化活性验证rHuHF-LYC的神经功能改善作用。rHuHF-LYC为脑保护和抗衰老提供了有效的策略。

Results and Discussion

rHuHF-LYC纳米颗粒的构建与表征

纯化的rHuHF（约480 kDa）仅由约20 kDa的一个亚单位形成（图1C），由于LYC的大小（长33.3 Å，宽10.9 Å）远远超出了rHuHF表面的通道（3～4 Å），LYC被rHuHF包裹在其内部腔内并稳定存在（图1A）。在此情况下，包封率和载药率分别为60.64%和6.06%（图1B），即LYC/rHuHF的平均颗粒比平均为56∶1，远高于姜黄素、芦丁、β-胡萝卜素等脂溶性物质。此外，rHuHF水溶液清澈透明，rHuHF-LYC溶液呈均匀鲜红色，游离的LYC呈固体颗粒悬浮（图1B）。纳米粒子仍然具有良好的纳米笼形态和均匀的直径（图1D），纳米笼尺寸的轻微扩展解释了它们的尺寸灵活性，不同的是，内化的LYC显著干扰rHuHF腔内铁的氧化成核。因此，当对蛋白球进行透射电子显微镜（TEM）成像时，更多的黑乙酸铀进入了rHuHF-LYC的腔内（图1E）。这表明LYC分子成功插入到rHuHF腔中，并伴随着LYC溶解度的巨大变化。包封有利于LYC分子在外界体系中的稳定，刚性rHuHF纳米笼包埋后二级结构和粒径没有变化（图1F和图G），为负载的LYC分子提供物理屏障和化学稳定作用。

图1 rHuHF-LYC纳米颗粒的构建与表征

LYC与其蛋白笼的相互作用使LYC分子稳定

由于LYC的易降解性和较强的抗氧化能力在保健功能食品中广泛应用，因此需要提高其稳定性以防止其生物学特性的丧失。刚性的rHuHF纳米笼稳定了LYC分子，作为保护屏障阻挡了外部系统的影响因素，rHuHF-LYC的热稳定性和抗氧化能力相比于游离的LYC都有很大的改善（图2A和B）。热降解动力学的回归系数（R2）分别为0.9558（LYC）和0.9945（rHuHF-LYC），表明LYC的降解保留量与反应时间具有良好的相关性。当降解速度减慢时，rHuHF-LYC纳米粒子中的LYC含量稳定在初始水平的85%左右，而游离LYC组在7 h时的LYC含量仅为78%，表明rHuHF的包封增强LYC的热稳定性。此外，当反应时间超过60 min时，rHuHF-LYC组对DPPH的抑制作用显著增强（P＜0.01），远高于游离LYC对照组。结果表明，由于壳状铁蛋白纳米笼的保护，LYC的抗氧化能力随着时间的推移保持良好。结果也说明了LYC分子与其蛋白笼之间可能存在的相互作用，从而保证了LYC分子的稳定性。

通过分子对接模拟计算了LYC分子与其rHuHF纳米笼之间的相互作用。高CDOCKER能量（−ECD）表明，LYC的结合位点位于四重轴通道附近的rHuHF-LYC纳米笼的管腔中，由ALA47、LYS49和LYS172组成，形成疏水键（图2C）。这种结合力可能促进了LYC分子成功包封到铁蛋白纳米笼中，从而导致两者相互作用引起的LYC的稳定性和溶解度。此外，通过ITC测定了rHuHF和LYC的平衡热变化及其参数。原始数据的拟合曲线揭示了rHuHF和LYC的结合（图2D2）。反应的ΔH（焓）、ΔS（熵）、ΔG（未显示）、结合常数Kd和n（表观结合化学计量）值分别为−1826 kJ/mol、−6 002 J/（mol·K）、−37.4 kJ/mol、4.572×10−7 mol/L和1.193。ΔH和ΔS为负，表明rHuHF与LYC之间存在良好的非共价相互作用。因此，结合反应可以是非特异性的、放热的（ΔH＜0）和自发的（ΔG＜0）结合反应。以上结果表明，将LYC包封到rHuHF纳米笼中可以通过相互作用提高LYC的稳定性和溶解度。

图2 rHuHF-LYC纳米粒子的稳定性与相互作用分析

血脑屏障的胞吞作用和神经元靶向能力的评估

rHuHF通过内源性受体介导转运发挥最佳纳米载体的作用，而TfR1在血脑屏障内皮细胞中大量表达，允许rHuHF通过内体室跨血脑屏障转移。为了验证rHuHF-LYC纳米复合物对血脑屏障的穿透，进行了血脑屏障跨细胞实验。在确认FITC-rHuHF-LYC不影响细胞存活的基础上，将其添加到人或小鼠血脑屏障内皮细胞的上腔（图3A和B）。FITC-rHuHF-LYC显著穿过人或小鼠BBB内皮细胞，而FITC-LFn（对照人L-铁蛋白）则没有。在1 h内，hCMEC/D3细胞几乎是FITC-LFn的5倍（P < 0.001）（图3C和D）。2 h后，较低的PC12细胞对FITC-rHuHF-LYC的吸收显著增加（P < 0.001）（图3E和图3f）。此外，FITC-rHuHF-LYC和溶酶体的荧光共成像显示其非共定位，Pearson相关系数分别为−0.11和0.16，表明FITC-rHuHF-LYC在BBB ECs中没有被吸收，而是被转运（图3G）。这些结果表明rHuHF-LYC能够在体外穿过血脑屏障。此外，FITC-rHuHF-LYC被PC12细胞明显吸收并与溶酶体共定位（图3H和J），Pearson相关系数为0.73（图3I），说明FITC-rHuHF-LYC可以进入神经细胞。这与BBB ECs transwell的跨细胞转运结果一致，共同证明了FITC-rHuHF-LYC可被神经细胞吸收。

图3 rHuHF-LYC穿越血脑屏障并被神经细胞摄取

rHuHF-LYC纳米颗粒作为神经元细胞内ROS清除剂的研究

在神经元微环境中，氧化损伤先于神经病理的发生，导致线粒体进一步损伤，甚至认知功能下降。一些研究强调了基于D-半乳糖（D-gal）的诱导脑衰老和神经元凋亡模型。在此，培养BV2和PC12细胞，研究rHuHF-LYC对D-gal诱导损伤的过氧化缓解作用。500 mmol/L D-gal可使BV2和PC12细胞达到IC50，加入rHuHF-LYC以剂量依赖性方式显著降低PC12细胞中的ROS水平（P＜0.05），这优于单独加入rHuHF（图4A）。此外，在PC12细胞中验证了rHuHF-LYC对细胞内SOD活性的调节（图4B），20 μg/mL及以上的rHuHF-LYC显著减弱了D-gal诱导的SOD活性下降（P＜0.05）。同样，D-gal诱导的PC12和BV2细胞的强ROS信号减弱，rHuHF-LYC处理后逐渐接近对照组的荧光强度（图4C、E、F），也减轻了BV2和PC12细胞的形态皱缩和凋亡倾向（图4D）。这些结果表明，rHuHF-LYC纳米粒子减弱了D-gal诱导的细胞过氧化反应。

图4 rHuHF-LYC对D-gal诱导的BV2和PC12细胞损伤的保护作用

此外，rHuHF-LYC显著减轻了BV2和PC12细胞的凋亡，表现为线粒体膜电位和磷脂酰丝氨酸外翻的变化（图5A）。荧光成像和定量分析显示，rHuHF-LYC的加入有利于维持完整的细胞形态（粉色和蓝色），减少碎片或凋亡（绿色），维持细胞黏附。rHuHF-LYC以剂量依赖性方式显著抑制凋亡PC12细胞的数量（图5B）。因此，在D-gal干扰下，BV2细胞对神经元的营养和保护作用减弱，而rHuHF-LYC在修复这些不良变化的同时，起到了直接保护神经元的作用。乙酰胆碱酯酶（AChE）和乙酰胆碱酯酶（ACh）是胆碱能系统的关键物质，在评价神经细胞状态方面具有重要作用。rHuHF-LYC显著抑制了D-gal损伤后BV2和PC12细胞中AChE活性的增加和ACh活性的降低（P＜0.05），减轻了D-gal诱导的神经细胞兴奋性降低或终止（图5C和D）。这些结果表明，纳米粒子通过维持抗氧化防御和线粒体功能在保护BV2和PC12细胞中发挥了至关重要的作用。

图5 通过rHuHF-LYC治疗减轻线粒体膜电位丢失和神经元凋亡

通过rHuHF-LYC调控PC12细胞凋亡相关蛋白的表达

通过蛋白质印迹法检测特征性的促/抗凋亡和衰老相关蛋白（图6），免疫印迹结果显示，与模型组相比，rHuHF-LYC纳米粒显著上调Bcl-xL和Bcl-2的表达（P＜0.05），下调p-AKT、Bad、Bax、cleaved caspase-3和p53的表达（P＜0.05）。rHuHF-LYC处理PC12细胞后，下调p-AKT水平引起线粒体介导的Bcl-xL/Bad值升高和Bax/Bcl-2降低。最后，rHuHF-LYC可显著下调cleaved caspase-3和p53的表达（P＜0.05），从而抑制神经细胞凋亡。rHuHF-LYC通过调控细胞内凋亡相关蛋白的表达水平，减缓PC12细胞的神经元凋亡。

图6 Western blot分析rHuHF-LYC对PC12细胞神经元凋亡相关蛋白表达水平的影响

Conclusion

综上所述，具有清除神经活性氧能力的rHuHF-LYC纳米粒通过保护神经元和改善神经微环境表现出优异的性能。rHuHF-LYC通过受体介导的内吞途径穿过血脑屏障并内化到神经元内。随后，PC12和BV2细胞的过度氧化和线粒体稳态失衡得到缓解。此外，rHuHF-LYC通过调节细胞内凋亡相关蛋白的表达水平，减缓PC12细胞的神经元凋亡。因此，rHuHF-LYC纳米颗粒抑制了不良神经微环境的发展，为对抗大脑衰老提供了一种有前景的治疗选择。

第一作者

夏小雨，女，工学博士，现为广东海洋大学食品科技学院讲师。研究方向为贝类蛋白构效关系及功能机制、靶向型生物纳米材料的功能营养精准递送。曾获博士国家奖学金、2024届辽宁省优秀博士毕业生、大连工业大学优秀博士学位论文。参与贝类产业技术体系项目、国家自然科学基金、湛江市科技计划等多个项目，以第一作者在ACS Nano、FSHW和JAFC等期刊发表论文9篇，参编著作1部，获授权发明专利3件。

通信作者

杜明，教授，大连海洋大学校长，博士研究生导师，大连工业大学食品学院/国家海洋食品工程技术研究中心朱蓓薇院士团队“蛋白质科学与技术”研究方向负责人。入选国家万人计划科技创新领军人才、科技部中青年科技创新领军人才、教育部新世纪优秀人才。兼任国务院食品与营养专业学位研究生教育指导委员会委员、辽宁省食品科学技术学会副理事长；学术兼职包括Food Frontiers、Food Science and Human Wellness、Protein and Peptide Letters、《食品科学》、《食品工业科技》、《食品工研究与开发》、《大连工业大学学报》等期刊编委。主要从事研究领域：（1）食源性蛋白构效关系及活性机制；（2）专用功能性蛋白质配料加工技术；（3）民族特色食品加工及产业化。主持国家十四五重点研发专项项目、国家十三五重点研发专项项目、国家自然科学基金重点项目等多项课题。作为主要完成人获省部级科技进步一等奖和二等奖各2项，省部级科技发明二等奖1项，国家教学成果二等奖1项。在Nature Communications、ACS nano、Chemical Engineering Journal等期刊以第一或通讯身份发表论文170余篇，论文总引用次数6400余次，H-index 43；参编《Mineral Containing Proteins》，《Biologically Active Peptides》等著作13部；制定“蛋白质基食品”相关行业标准3项，第一发明人授权国家发明19项。

Ferritin nanocage loading lycopene for improving blood-brain barrier transcytosis and attenuating D-galactose-induced apoptosis in PC12 cells

Xiaoyu Xiaa,b,c, Han Lia,b,c, Xianbing Xua,b,c, Zhenyu Wanga,b,c, Junjie Yid, Guanghua Zhaoe, Ming Dua,b,c,*

a School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

b Collaborative Innovation Centre of Provincial and Ministerial Co-construction for Seafood Deep Processing, Dalian 116034, China

c National Engineering Research Centre of Seafood, Dalian 116034, China

d Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China

e College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Aging is a physiological process that leads to degeneration and functional decline of the brain. This is accompanied by intracellular peroxidation and neuronal apoptosis. Natural antioxidants possess a remarkable effect on attenuating the oxidative stress cascade and apoptosis of neurons; however, the challenge of using natural antioxidants for neuroprotection is fabricating a delivery system to overcome the blood-brain barrier (BBB) transport. Herein, we successfully created a stable delivery platform built on rigid ferritin nanocage loading natural lycopene molecules, crossing the BBB in quantity and being taken up in neurons. This nanoparticle worked on D-galactose-induced senescence via alleviating neuronal hyperoxidation injury and weakening neuronal apoptosis in PC12 and BV2 cells. More importantly, this natural delivery system possesses inherent biocompatibility and potential application in improving the bioavailability of bioactive edible compounds with low water solubility. This study demonstrated the effectiveness of natural antioxidant nanomedicines in maintaining the defenses of intracerebral peroxidation and improve degenerating neurons, providing the potential to combat further imbalances of neuronal microenvironment in aging neuropathy.

Reference:

XIA X Y, LI H, XU X B, et al. Ferritin nanocage loading lycopene for improving blood-brain barrier transcytosis and attenuating

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编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意