《食品科学》：集美大学曹敏杰教授等：鲍源ACE/ACE2双靶点活性肽的分离及其活性分析

高血压是全球主要公共健康问题。血管紧张素转换酶（ACE）和其同源酶ACE2在肾素-血管紧张素-醛固酮系统中发挥不同作用，共同调控血压。ACE可催化血管紧张素（Ang）I转化为具有强缩血管作用的Ang II，促进血管收缩、交感兴奋和醛固酮的释放，使血压升高；而ACE2则将Ang II水解生成Ang-(1-7)，具有血管舒张和抗增殖作用。高血压患者常因ACE与ACE2的失衡导致Ang II积累和Ang-(1-7)减少，加剧血管损伤及器官纤维化。因此，抑制ACE活性和增强ACE2活性为开发抗高血压治疗提供了重要策略。

近年来研究表明，鲍鱼蛋白经酶解后可释放出具有特定生物功能的肽段，其中部分肽具有ACE抑制活性，对调节血压具有潜在作用。此外，鲍鱼富含的牛磺酸亦被证实具备降血压和心血管保护效应。

集美大学海洋食品与生物工程学院的李萌、张捷凯、曹敏杰*等实验拟以福建高产鲍鱼为原料，旨在制备具ACE抑制与ACE2上调活性的双靶点降压肽，发掘其在血压调控中的应用潜力，以期为开发安全高效的海洋功能性降压肽提供理论依据和技术支撑。

1 鲍鱼酶解液的制备

酶解法已成为制备食源性生物活性肽的常用技术，具有效率高、可扩展性强等优点，但其效果高度依赖水解条件的优化。本研究选用5 种商业蛋白酶对鲍鱼肌肉进行酶解，发现中性蛋白酶酶解产物的ACE抑制率最高，为（80.05±0.54）%，木瓜蛋白酶产物在ACE2上调方面表现突出（图1A）。综合两者活性，选用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行进一步优化。由图1B、C可知，随着木瓜蛋白酶添加量增加与酶解时间的延长，ACE抑制率逐渐升高，最终趋于稳定。可能是高分子质量肽的减少或反应达到平衡导致水解反应速率趋于稳定。结合ACE2上调活性，确定加酶量为0.6%，酶解时间120 min。为提高酶解效率进行二次酶解，以最大化水解鲍鱼肌肉蛋白。由图1D可知，随着中性蛋白酶添加量的增加，酶解效果逐渐增强。但是，添加量过高时，活性肽可能过度水解，导致ACE2活性下降。最终结合ACE和ACE2活性，确定二次酶解最适条件为加酶量0.6%、酶解时间2.5 h（图1E），通过2 次酶解获得鲍鱼肽酶解液。

2 鲍鱼ACE/ACE2双靶点降压肽的分离纯化

将酶解液经3 kDa超滤膜分离为＜3 kDa与＞3 kDa两大组分，冻干复溶后测定其ACE抑制活性及ACE2上调活性。图2A显示，＜3 kDa组分的IC50为1.36 mg/mL，显著低于＞3 kDa组分的2.59 mg/mL，表明其ACE抑制活性更强，可能因后者含未完全酶解的大分子肽，难以进入ACE活性位点。如图2B所示，＞3 kDa组分对ACE2上调效果更明显，但小分子肽更易被肠道吸收。因此，＜3 kDa的组分因其较强的ACE抑制活性和吸收特性，进行后续研究。

将＜3 kDa组分经SuperdexTM peptide 10/300 GL凝胶柱分离，获得F1和F2两个组分（图2C）。对两个组分冻干复溶后测定其活性，F1的IC50为0.74 mg/mL，明显优于F2的3.45 mg/mL。ACE2活性测定结果如图2D所示，其活性随F1质量浓度增加表现出良好上调趋势。基于其优异活性，选取F1进行进一步纯化。F1冻干后复溶，通过TSK gel G2000 SWXL柱分析分子质量分布（图2E、表1），结果显示其中99.99%成分低于3 000 Da，且＜1 000 Da占比达96.63%。

将F1组分冻干后复溶至质量浓度为10 mg/mL，过0.22 μm滤膜后上样于ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱，共获得17 个组分，分别标记为a～q（图3A）。各组分冻干复溶后测定其ACE抑制及ACE2上调活性。ACE抑制结果显示：c＝f＞d＝h＝i＞a＝j（图3B）；ACE2上调效果为：f＞l＞q＞对照（F1组分）（图3C）。基于上述结果，选择组分f进行

De novo

测序分析。

3 氨基酸序列鉴定

组分f经鉴定获得26 个鲍鱼来源的肽段，长度为7～12 个氨基酸（表2）。考虑到体内消化酶会将活性肽降解为更小片段，需评估这些肽经胃肠道消化后产物的活性。利用BIOPEP数据库模拟胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的胃肠消化，得到的肽段及这些消化产物对ACE抑制作用的结果是否已有报道列于表2。

4 分子对接

根据BIOPEP预测结果，对消化后尚未被报道的多肽进行分子对接模拟，以筛选潜在ACE抑制肽。结合自由能作为筛选依据，结合能越低表明结合越稳定。对接结果（表3）显示，AGF、ATK、PIITK、AK、PVGR和PW与ACE的结合自由能较低，因此选择这6 个肽段进行固相合成。

研究发现，ACE的活性依赖于3 个关键位点：S1、S2和S1’，分别包含氨基酸残基ALA354、GLU384、TYR523（S1），GLN281、HIS353、LYS511、HIS513、TYR520（S2）及GLU162（S1’）。其中，锌离子在催化中心由GLU411、HIS387和HIS383配位，是其酶活性的核心。ACE抑制肽可通过与这些残基的多种非共价作用（如氢键、盐桥、疏水作用等）结合，干扰其催化结构，实现抑制作用。

如图4A所示，PIITK可与ACE活性位点多处残基作用：与S1口袋中的HIS383和HIS353形成氢键，并与S1’口袋中的GLU162以及周围氨基酸ASP453、GLU376、ASP377通过盐桥相互作用。此外，PIITK与S1口袋中的TYR523，S2口袋中的HIS353、HIS513以及周围氨基酸TRP279、HIS383通过烷基与π-烷基相互作用，显著增强与ACE的结合稳定性。

如图4B所示，PVGR可通过氢键与S1口袋的ALA354、GLU384以及S2口袋的GLN281、LYS511结合，并与GLU384、ASP453、GLU376等形成盐桥。其中，GLU384是锌离子结合的关键残基，对增强抑制效果具有重要意义。此外，PVGR还可与锌四面体配位结构中的残基产生疏水作用，进一步破坏其稳定性，从而抑制ACE的活性。

因此，PIITK和PVGR等降压肽通过氢键、盐桥及疏水作用与ACE活性口袋关键残基结合，显著提升与ACE的结合稳定性，并可能通过影响其结构和催化中心从而增强其抑制作用。

5 合成肽的体外功能活性

根据分子对接结果，选择AGF、ATK、PIITK、AK、PVGR和PW 6 种多肽进行固相合成。经质谱鉴定与纯度分析，6 种肽纯度均超过95%。

测定了6 种合成肽在终浓度为1.0 mmol/L时的ACE抑制率（图5A），其中PIITK和PVGR抑制率均超50%，其余肽低于50%。进一步测定IC50值，PIITK为0.854 mmol/L（95%置信区间（CI）：0.791～0.922），PVGR为0.771 mmol/L（95% CI：0.702～0.842）（图5C、D），表明两者具备调节血压的潜力。此外，在1.0 mmol/L条件下，PW对ACE2上调作用最显著，其次为PVGR、AK与ATK；PIITK无显著上调作用，AGF则抑制ACE2活性（图5B）。综合分析，选定PIITK和PVGR进行后续研究。

6 抑制动力学分析

采用Lineweaver-Burk双倒数法分析不同浓度PIITK对ACE的抑制模式（图6A）。结果显示，随PIITK浓度升高，ACE的最大反应速度（

V

max ）和米氏常数（

K

m ）均呈现减小趋势，拟合曲线在第二象限交汇，表明其为混合竞争性抑制模式。即PIITK通过结合ACE活性位点，同时影响酶的催化效率与底物亲和力，从而抑制酶活性。这与鲭鱼肌肉蛋白来源的PLITT的抑制模式一致。类似的，来自刺参的SAAVGSP以及从鸡胸肉中获得的KPLL和KPL也表现出混合性抑制作用。

如图6B所示，PVGR在不同浓度下拟合曲线交于Y轴正半轴，ACE的

V

max 保持恒定，而

K

m 逐渐增大，表明其为典型竞争性抑制剂。PVGR通过与底物竞争ACE活性位点结合，阻碍底物进入酶的催化中心，抑制其反应效率。这与石莼来源的ACE抑制肽KAF的抑制类型相符。大多数ACE抑制肽，包括降压药物卡托普利、依那普利和赖若普利，均通过竞争性抑制与ACE结合。

7 动力学模拟

分子动力学模拟可揭示多肽-ACE复合物的构象变化与稳定性。均方根偏差（RMSD）衡量构象稳定性，值越小说明结构越稳定。因此，本研究通过RMSD评估体系稳定性（图7A），PIITK-ACE体系在80 ns后趋于稳定，RMSD波动约3.3 Å；PVGR-ACE体系在40 ns后趋于平衡，RMSD约为2.5 Å，表明其结合更稳定。此外，两个体系的回转半径（

R

g ）与溶剂可及表面积（SASA）呈轻微波动（图7B、C），提示复合物存在一定构象调整。

均方根涨落（RMSF）是衡量蛋白质中氨基酸残基柔性的常用指标。如图7D所示，两体系大部分残基RMSF低于3 Å，说明体系柔性低、结构稳定。

氢键作为配体与蛋白质结合的重要作用力，能够稳定复合物结构。氢键分析表明，PIITK-ACE与PVGRACE在动力学过程中形成0～6 个氢键，平均保持3 个左右（图7E），显示两者与ACE具有良好的结合力。

自由能景观（FEL）可视化蛋白-配体相互作用的稳定状态，能量团簇越集中越稳定。FEL分析进一步揭示了蛋白-肽复合物的能量状态（图7F、G）。PVGR-ACE复合物呈现更深且集中的能量谷，能量屏障更高，代表其结合构象更稳定。

综上，PIITK-ACE和PVGR-ACE复合物均展现出良好的稳定性与结合亲和力，特别是PVGR-ACE体系，其更低的RMSD值、更强的氢键作用及更稳定的自由能分布，这为其作为降压肽的潜力提供了有力的理论支持。

在多肽结构-功能关系研究中，氨基酸组成、链长及结构特征对ACE抑制与ACE2激活活性具有重要影响。疏水性残基（如PRO、VAL、PHE）有助于嵌入ACE的S1/S2口袋形成疏水相互作用，正电荷残基（如ARG、LYS）则有利于与ACE2表面负电区域结合，从而提升活性。其次，肽段长度在4～8 个氨基酸范围内可兼顾口袋识别和胃肠道稳定性，过短的二肽或三肽难以完全覆盖活性位点，过长的肽则易被蛋白酶降解。本研究筛选获得的PVGR和PIITK均符合这一规律。PVGR中的PRO与VAL增强与ACE的疏水相互作用，ARG残基则通过静电作用增强对ACE或ACE2的结合，短链结构兼具口袋覆盖与柔性稳定性。PIITK中的双ILE构建疏水核心，THR羟基与LYS末端通过氢键和离子键增强与ACE关键残基GLU411、HIS387和HIS383的结合，维持构象稳定并抵抗酶解。分子对接和动力学模拟显示，PVGR-ACE体系的RMSD更低、氢键更丰富，而PIITK-ACE复合物在关键残基处保持高度刚性，分别解释了两者不同的抑制模式。构效关系揭示了两种肽产生活性的机制，为鲍鱼降压肽的序列优化与功能开发提供理论支持。

结论

ACE与ACE2在血压调控中具有协同作用，但传统降压肽筛选大多聚焦于ACE。本研究引入ACE2上调活性作为辅助筛选指标，建立双重筛选体系。以鲍鱼肌肉为原料，经分步酶解、超滤、凝胶过滤层析及RP-HPLC纯化后，获得26 条鲍鱼源降压肽。分子对接结果显示AGF、ATK、PIITK、AK、PVGR和PW与ACE结合自由能较低。ACE抑制实验中，PIITK与PVGR的IC50分别为0.854 mmol/L和0.771 mmol/L，ACE2调控中PW上调作用最显著，其次为PVGR、AK和ATK。分子动力学分析显示，PIITK-ACE与PVGR-ACE复合物均稳定，PVGRACE体系RMSD更低、氢键更丰富，表明其结合更紧密。本研究在肽段筛选与体外验证方面取得进展，但仍缺乏动物学实验及稳定性评估。未来应完善动物学实验，优化酶解工艺以提升产率、降低成本，为实现产业化奠定基础。

作者简介

通信作者：

曹敏杰 教授

享受国务院政府特殊津贴专家，中国水产学会水产品加工与综合利用分会副主任委员。长期从事水产品加工及副产物高值化利用、食品生物技术等方向研究工作。先后主持国家自然科学基金、“蓝色粮仓”国家重点研发计划项目课题等国家级、省部级科研项目50余项，在国内外学术刊物发表论文240余篇。获福建省科技进步奖3项，自然科学奖2 项，以第一发明人获国家授权发明专利15 件。担任《Food Science and Human Wellness》《Journal of Ocean University of China》《水产学报》《食品科学》《食品工业科技》等刊物编委。

第一作者：

李萌 硕士研究生

李萌，女，硕士研究生就读于集美大学，研究方向为水产品加工及贮藏工程。

本文《鲍源ACE/ACE2双靶点活性肽的分离及其活性分析》来源于《食品科学》2025年46卷第19期124-133页，作者：李萌，张捷凯，何弼璐，翁凌，张凌晶，孙乐常，曹敏杰*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250402-019。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网