旋转盘共焦点显微镜的演变

　　图1： 旋转盘系统成像。图像显示用Crest X-Light V3旋转盘系统成像哺乳动物细胞，盘旋转速度从静止(A)到运动(B-C)再到全速(D)。

　　介绍

　　旋转盘共聚焦显微镜(SDCM)是生命科学成像领域的革命性工具，能够观察从单分子到活细胞的样品，具备高速、三维和多通道采集能力。许多实验和研究人员使用SDCM成像系统进行成像，该技术已非常成熟。

　　SDCM允许高速进行光学切片(从厚三维样品成像二维平面)，相比广视场，光损伤或漂白显著减少。当与高灵敏度相机配合使用时，SDCM成为生命科学成像领域的强大技术。SDCM主要用于多通道、高速、高分辨率的活样本三维成像，且可能长期使用。较厚的样品可用于三维成像，如斑马鱼和脑组织，但较小、低光的样本则可受益于SDCM，如神经回路、肌动蛋白细胞骨架和线粒体。

　　本文将探讨SDCM的过去、现在和未来的应用、现代系统的能力，以及SDCM未来可能的发展和演进。

　　过去

　　早期的共軛焦显微镜采用激光点扫描(LSCM)，具有单个针孔和探测器，如光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)。这些探测器具有低量子效率(QE)，即光子转化为电荷电子以产生图像的速率。低QE时，信息因光散射或传感器设计效率低下而丢失。PMT/APD的QE在20%至40%之间，意味着这些成像系统效率不理想，限制了信噪比(SNR)。

　　当SDCM问世时，它们提供了更高的速度、更少的光漂白以及科学相机探测器。由于针孔阻挡照明光线，早期SDCM受益于高灵敏度大像素相机，如EMCCD。EMCCD的电子倍增特性使得读取噪声极低，在低光环境下成像效果显著，尤其与较慢且灵敏度较低的替代CCD技术相比。

　　用于旋转盘的EMCCD

　　光度测量公司于2000年推出了首个科学级EMCCD系统——Cascade 650。此后，Photometrics Evolve系列EMCCD非常适合早期SDCM，像素尺寸可达24×24微米，QE可达95%，这得益于背光。在速度方面，Evolve 128 最高可达 530 帧每秒，能匹配旋转盘的速度。

　　然而，EMCCD存在若干缺点：

　　EMCCD价格昂贵，因此并非所有SDCM研究人员都能轻松获得。

　　EMCCD具有电磁增益衰减，这些相机寿命有限且随时间衰减，需要定期校准以实现定量或可重复实验。

　　EMCCD具有过剩噪声因子，由于电子倍增的随机性质，光子发射噪声会被乘以1.4倍。

　　由于传感器体积小，EMCCD的视场(FOV)可达11毫米对角线。

　　由于像素大，EMCCD必须与高倍率匹配以实现奈奎斯特采样。

　　EMCCD通常使用火线接口，这较为罕见。

　　EMCCD的局限性也导致SDCM系统出现妥协，这些系统设计以匹配典型CCD/EMCCD标准，具有较小的视场角、针孔直径/间距和微透镜焦距。图2中可见有限的SDCM视野，展示了CSU-X1旋转盘系统，视野对角为12毫米。早期的SDCM扫描速度范围在1500-5000转/分钟之间，可成像高达1000英尺/秒，但较慢的探测器限制了最终采集速度。

　　EMCCD是一项成熟技术，我们的Photometrics Evolve系列与SDCM成像系统配合得很好。然而，成像和相机传感器技术不断发展，使CMOS技术成为前沿。

　　图2：早期SDCM视角与相机传感器尺寸的对比。A) 22毫米sCMOS传感器，B) 18.8毫米sCMOS传感器，C) CSU-X1旋转盘系统的视野(颜色表示光强)，D) 11毫米CCD传感器，E) 11.6毫米EMCCD传感器。图片来源：Orepoulos等人(2014)。

　　目前

　　如今距离首个科学级EMCCD问世已逾20年，旋转盘共聚焦技术问世已逾50年。在此期间，SDCM技术在多种方面进行了演进：

　　最新的sCMOS相机传感器现在具备背光、最高25毫米视场、不同倍率的奈奎斯特像素尺寸、95%的QE和高速采集速度

　　更大的视场显微镜和SDCM系统支持对角线最大25毫米的成像。

　　适用于小于~200纳米的成像样品的超分辨率双盘SDCM系统。

　　磁盘最高可转速达到15,000转/分钟，实现更高的成像速度和实时动态样本捕捉。

　　SDCM系统可以使用多台sCMOS相机进行成像，以同时捕捉多个波长。

　　科学相机与旋转盘技术同步发展，使研究人员能够突破成像工作的限制。

　　背光式sCMOS与EMCCD在旋转盘上的比较

　　光度测量再次引领潮流，2016年推出了全球首款背光sCMOS相机Prime 95B。Prime 95B 拥有近乎完美的 95% QE，像素大小为 11×11 微米，视野范围可达 25 毫米，是现代 SDCM 成像的理想相机。图3展示了用EMCCD拍摄的图像与SDCM系统上Prime 95B的差别。

　　图3： EMCCD与Prime 95B的旋转盘，灵敏度比较。这两张照片均使用Crest X-Light V3，分辨率60倍，1.4 NA，曝光30毫秒。EMCCD产生的多余噪声相比Prime 95B更好的信噪比清晰可见。

　　得益于高量子效应、大像素和低读数噪声，Prime 95B 是一款高灵敏度的相机，能够在低光条件下与 EMCCD 竞争。此外，Prime 95B的视野更大，速度更快，解析能力也比EMCCD大得多，同时成本更低，避免了EMCCD经典的缺点，如EMCCD随时间衰减和噪声因子过剩(如EMCCD图像图3所示)。512×512 EMCCD与25毫米sCMOS的视场差可以在图4中更清晰地看到，通过对比图3中同一样品但全传感器。关于EMCCD与Prime 95B在旋转盘系统上的更多对比，请参见我们的技术说明。

　　图4：EMCCD与Prime 95B的旋转盘，视场对比。这两张照片均使用Crest X-Light V3，分辨率60倍，1.4 NA，曝光30毫秒。Prime 95B 的视野为 25 毫米，而 512×512 EMCCD 为 11 毫米。

　　旋转盘用背照 sCMOS 与前照 sCMOS 的比较

　　前置照明的sCMOS相机具有较低的量子效应，但也可以使用分体传感器，这常常导致伪影和固定模式噪声，这些都会影响低光环境下的成像效果。前照射分离式传感器与后照式Prime 95B单传感器的效果可见图5。

　　图5： Prime 95B 与前置照明 sCMOS 用于旋转磁盘。这两张照片均使用Crest X-Light V3，分辨率60倍，1.4 NA，曝光30毫秒。

　　采用现代背照sCMOS实现了目前最高的峰值量子输出，干净偏置且无图案/伪影，视场(FOV)和采集速度相较EMCCD大幅提升。许多现代SDCM系统采用背照式sCMOS技术，实现了诸多优势，使SDCM成像能够在大视场内快速动态拍摄实时样本，同时不牺牲灵敏度和信噪比。

　　超分辨率旋转盘

　　正如我们在关于超分辨率旋转盘共軛显微镜的文章中所述，有些旋转盘系统能够将光和图像样本的绕射极限控制在~200纳米以下，同时保持SDCM的高速和三维光学切片功能。

　　本质上，由于共軛焦显微镜的双针孔结构，SDCM中存在两个点扩散函数(PSF)：激发PSF和发射PSF。这两个PSF被抵消，通过缩窄和调整这两个PSF，理论上系统的分辨率可以提升√2倍，解卷积后可提升至2倍。

　　这种PSF的狭窄其实可以用更小的针孔来实现，但这样会阻挡过多的光线。相反，光学光子重新分配是通过针孔盘底部的另一组透镜进行，缩小PSF并将光子重新分配到最可能的起源位置，如图6所示。

　　图6：超分辨率SDCM的光路。与标准SDCM的关键区别在于针孔阵列盘底部加装了微透镜(以红色方块标示)。左下角的插图展示了这些新型微透镜如何允许来自多达两倍角度的光线通过针孔。这通过光学光子重分配提高了分辨率。图片改编自(Azuma 和 Kei 2017)。

　　这些超分辨率SDCM系统最大分辨率限制为~120纳米(标准SDCM约为~250纳米)，并可使用大多数荧光染料以最高200 fps(旋转盘4000转/分钟)成像活样本。这为追求更高速度和更好三维成像的超分辨率成像研究人员以及希望分辨更小样本的成熟SDCM研究人员提供了许多选择。

　　超分辨率(及单分子定位显微镜)技术如光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)也与SDCM兼容。这些技术也被证明能受益于超分辨率处理算法，如超分辨率光学涨落成像(SOFI)。

　　超分辨率旋转盘相机

　　由于这些系统拥有极高的最大分辨率，因此有必要将它们与能够在超分辨率下采样、高灵敏度和速度的现代相机配对。背光式sCMOS相机是这些系统的理想选择，但根据像素大小，相机与相应光学元件配对非常重要。例如，Prime 95B sCMOS 采用 11 微米像素，而 Prime BSI、BSI Express 和 Kinetix sCMOS 相机则采用更小的 6.5 微米像素。这些相机分别支持240倍或280倍倍放大，支持62纳米和90纳米的奈奎斯特采样，这两种都适合从120纳米进行过采样。

　　6.5微米相机较小的像素尺寸可能略有提升分辨率，但代价是灵敏度降低，探测光子数量比11微米相机少2.2倍。另一方面，11微米像素相机提升对比度，缩短曝光时间，同时仍能实现足够的过采样以实现有效的解卷积。这凸显了像素尺寸在选择与超分辨率SDCM系统配对的背照sCMOS时的重要性。

　　更高分辨率成像的能力使研究人员能够揭示更小的样本，同时揭示现有样本的细节。通过将现有SDCM系统升级至超分辨率水平，可以以高灵敏度、超高分辨率和高速拍摄活体生物样本的强力图像。该技术能够在生物医学常规研究中实现可靠的超分辨率观测，是先进显微镜的重要组成部分。

　　高速旋转盘

　　在典型的SDCM和Nipkow盘中，图像的每个区域大约每旋转30°一次，由单个针孔扫描。通过加快旋转盘，可以提高最大图像采集速度。例如，一个针孔为50微米、针孔间距250微米的盘，每转12帧，若以5000转每分钟(rpm)旋转，潜在的每秒1000帧(fps)。如果该盘旋转更快，采集速度会提高。

　　但并非所有SDCM系统都有类似的磁盘。另一种视角较大的系统需要更大的微透镜来增加焦距。这些较大的微透镜需要更大的针孔或针孔间距。一个大视野SDCM系统，针孔直径为50微米，针孔间距为500微米，每转只能拍3帧，速度远低于4000转/分钟时约200帧。通过这种方式，不同的SDCM系统由于其磁盘模式的特性，可以实现不同的速度。但对于所有这些系统，盘旋转速度越快，最大采集速度越高。

　　在撰写时，旋转磁盘系统最高可达15,000转/分钟，从而实现极高的潜在帧率。然而，只有当高速SDCM系统与高速摄像机配合时，才能实现如此高速的采集。

　　高速旋转盘用相机

　　在捕捉高速动态过程(如钙成像)时，需要较短的相机曝光时间。这些曝光时间需要尽可能接近磁盘扫描图像所需的时间，以便理想捕捉高速过程。如果曝光时间低于扫描时间，图像部分未被扫描，图像上会出现黑线条纹，如图7所示。

　　图7： 在HeLa细胞样品上可见条纹伪影，这是由于相机曝光和盘旋转不同步、盘转速度和短曝光时间时，样品覆盖度不均所致。在100x 1.49NA物镜上拍摄，比例条为10微米。摘自(Stehbens 等，2012)。

　　在高速采集下，解决该问题的方法是将相机曝光与磁盘扫描同步，确保曝光时间等于扫描时间的整数倍。这需要高速摄像机和先进的触发选项，以便摄像机采集能与磁盘旋转同步。光度测量sCMOS相机同时具备高速和硬件触发功能。

　　Kinetix sCMOS 在完整的 29.4 毫米传感器上可实现高达 500 fps 的速度，裁剪该传感器后速度线性提升，轻松达到数千帧，甚至能与最快的 SDCM 系统媲美。此外，Kinetix 还能在高灵敏度低读噪声 CMS 模式下实现超过 100 fps，实现高速、大视野和高灵敏度的结合。高速背光sCMOS相机使SDCM系统的全部潜力得以发挥，尤其是在盘子能以最高15,000转/分钟的速度旋转时。

　　同时多通道成像

　　许多现代SDCM系统具备连接多台相机以实现双通道检测或其他多相机应用的能力，如多焦点成像或不同偏振成像。此外，某些技术如福斯特共振能量传递(FRET)也可受益于多摄像头。SDCM上的多台相机可以是同一型号的相机，以保证实验一致性，也可以是明显不同的相机。不同规格的相机可以在同一SDCM系统上使用，从而在同一个样品上实现不同的视场、像素大小和放大倍率。通过在相机和物镜之间切换，可以相对轻松地在同一SDCM系统上进行截然不同的实验。

　　前途

　　随着SDCM成像系统从过去到现在取得的巨大进步，这些系统未来将如何发展?成像技术与显微镜同步进步，下一代sCMOS模型已以Kinetix sCMOS的形式出现。Kinetix的技术有助于了解影像未来的发展方向。

　　Kinetix sCMOS：更大，更快

　　Kinetix sCMOS是下一代sCMOS相机的一部分，能够成像样品，并实现可能无法用现有技术捕捉的实验设计。

　　Kinetix拥有极高的速度，全传感器最高可达500帧，在较小画面拍摄时轻松达到>1000帧及以上。由于当前滤镜立方体和相机卡口尺寸的限制，Kinetix拥有巨大的29.4毫米对角角视角，传感器尺寸也超过了大多数显微镜系统能成像的范围。这种速度和传感器尺寸的结合使 Kinetix 能够轻松超越典型的 sCMOS 设备，提供超过 4000 万像素/秒的数据。结合95%量子化、平衡的6.5微米像素尺寸和先进的触发选项，Kinetix将推动成像行业的发展。

　　图8： Kinetix是一款背光式sCMOS，配备大型传感器，能够以极高速度成像，同时保持极高的灵敏度。

　　可修改针孔盘

　　由于某些磁盘针孔尺寸针对不同的相机像素尺寸、物镜放大倍率、磁盘速度以及避免串扰进行了优化，能够实时改变针孔大小或位置将极具优势。针孔越小，系统的最大分辨率越高，但被阻挡的光也越多。结合小针孔、低倍率、高数值光圈镜头和高灵敏度背光sCMOS相机，可以在不牺牲分辨率的情况下实现跨大视角的SDCM成像。打开针孔可以获得更多照明和更好的对比度，但会牺牲针孔串扰，但这些可以配合理想荧光探针来减轻这种影响。

　　通过SDCM系统，可以更换磁盘或修改单个磁盘，能够同时改变针孔直径和针孔间距，将为实验提供极大的灵活性。通过实验其他类型的针孔，如狭缝或孔径，将使SDCM成像能够探索更广泛的实验。

　　反褶积

　　虽然SDCM可以产生高分辨率图像，尤其是超分辨率SDCM，但通过计算后处理步骤如反卷积，这一效果还能进一步提升。这些步骤可能耗时且计算量大，但未来将出现更多实时反卷积选项，无论是在SDCM系统还是现代sCMOS相机中。目前有多种开源的3D反卷积方案可供标准计算机运行，使研究人员能够提升系统的最大分辨率。

　　其他算法可用于去除图像噪声，减少噪声源(如光子散射噪声)的影响，这些噪声源会影响成像的信噪比，但由于光子的随机性，处理起来较为困难。

　　多光子旋转盘

　　正如我们在双光子显微镜应用说明中所述，多光子成像使用两个或更多近红外(NIR)光子，以便在三维样品中成像深层(可达数毫米)，这是由于可见光和红外线吸收系数不同。通过将多光子成像与SDCM结合，高速成像可以在活体组织深处进行，为大型模型生物提供强大的平台。

　　然而，需要注意的是，多光子SDCM依赖于多个针孔上的多脉冲红外激光，限制了照明面积。

　　总结

　　SDCMs在生命科学领域一直发挥着重要作用，通过光学切片实现活体三维样本成像。这些成像系统自诞生以来发生了显著变化，视野、分辨率和最大想象速度均有所提升。在整个演变过程中，SDCM系统一直由一系列光度科学相机支持，这些相机的成像能力也随着时间推移大幅提升。

　　通过对旋转盘针孔、微透镜和转速进行调整，SDCM成像可以灵活且根据您的实验需求进行调整。然而，发展SDCM成像的理想方式之一是使用现代背光sCMOS相机，这将提升你的成像速度、分辨率、灵敏度和视野，并根据你的样品和成像需求进行调整。

　　欲了解更多信息，请参阅我们关于旋转盘共聚焦显微镜的应用页面，了解最适合该应用的相机，以及如何在您的系统上演示。