北京
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人神经母细胞瘤是常见的儿童颅外恶性肿瘤，属于中枢神经系统肿瘤的一种。目前神经母细胞瘤的治疗方式主要有手术、放疗、化疗、骨髓移植等，但治疗后遗症的风险很高，顺铂是一种常见的化疗药物，但其治疗效果不理想，而且会引起严重的副作用。与合成药相比，大多数天然化学产物更安全，副作用更小，越来越多的研究表明，酚类、萜类、类黄酮等天然小分子化合物在癌症治疗中具有重要意义。
铁死亡是一种由二价铁和脂质过氧化共同介导细胞新型的死亡方式，癌细胞比非癌细胞更依赖铁满足其快速增殖的需要，主要形态表现为线粒体萎缩、膜密度增加和嵴减少。磷脂中的多不饱和脂肪酸、Fe2+过载和脂质过氧化物修复不足是引发癌细胞发生铁死亡的3 个重要源头，它们决定了癌细胞对铁死亡的敏感性。推测XN对肿瘤细胞的损伤可能通过氧化应激及铁死亡发挥作用，但具体机制尚不清楚。
烟台大学生命科学学院的褚红丹、贺红军*、许波*等以SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞作为体外肿瘤细胞模型，考察XN对SK-N-SH细胞的增殖抑制作用，从氧化还原稳态角度探讨XN的毒性作用并确定SKN-SH细胞的死亡方式，以期为揭示啤酒花的药用价值和XN的抗肿瘤生物价值提供更多的理论依据。
01
XN对SK-N-SH细胞的杀伤作用
如图1所示，与对照组相比，XN显著抑制了SK-N-SH细胞的增殖活性。如图1a、b所示，随着XN浓度增加（10～40 μmol/L）和处理时间延长（24～72 h），细胞活力显著降低（
P＜0.05）。因此，XN对于SK-N-SH具有细胞毒性，且随着孵育时间延长，细胞未产生抗药性。进一步检测采用10 μmol/L和20 μmol/LXN孵育24 h对SKN-SH细胞死亡率的影响，如图1c所示，20 μmol/L XN孵育组SK-N-SH细胞的死亡率达到20%，相较于对照组极显著增加（
P＜0.01），同时又不至于细胞存活率过低影响后续实验，故采用10 μmol/L和20 μmol/L浓度的XN孵育24 h进行后续实验。同时，使用LDH试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放水平，结果显示（图1d），经XN孵育后，培养基中LDH活力显著升高，与对照组相比，20 μmol/L XN组LDH活力增加41%（
P＜0.01），表明XN可导致SK-N-SH细胞细胞膜破裂，进一步证明XN对于SK-N-SH具有杀伤效果。
02
XN对SK-N-SH细胞内脂质氧化的影响
现有研究表明，ROS在天然化合物抗肿瘤中发挥重要的作用，在XN的孵育下，SK-N-SH细胞内总ROS水平提高（图2a）。但是XN能否引发脂质过氧化应激尚待研究。所以进一步探究经XN孵育后，脂质ROS和脂质过氧化物MDA在细胞内的含量，如图2b、c所示，经20 μmol/L处理后，SK-N-SH细胞内的脂质ROS和MDA分别增加了12%和120%，具有显著性差异（
P＜0.05、
P＜0.01）。
03
XN对SK-N-SH细胞还原力的影响
为探究脂质ROS产生和脂质氧化的原因，进一步研究XN对SK-N-SH细胞抗氧化能力的影响。G6PDH催化葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖醇δ-内酯，同时伴有NADP+还原为NADPH。产生的NADPH在生物氧化还原系统中起着供氢体的作用，对维持细胞的还原力水平具有重要意义。NADPH能动态维持GSH的还原态水平，进而保护细胞免受ROS自由基累积造成的氧化损伤。如图3a～c所示，与对照组相比，20 μmol/L XN处理后，细胞内G6PDH活力、NADPH及GSH水平极显著降低（
P＜0.01）。
GPX4是GPX家族中最重要的成员，是GPXs家族中唯一保护生物膜免于过氧化损伤的酶。如图3d所示，当用XN处理细胞24 h后，随XN浓度增加，GPX4的表达量极显著降低（
P＜0.01）。因此，XN孵育后，SK-N-SH细胞的脂质抗氧化能力降低，并且发生细胞膜损伤。
04
XN对SK-N-SH细胞Fe2+的影响
为深入探究XN诱导SK-N-SH细胞死亡的具体方式，使用FerroOrange探针检测细胞内Fe2+含量。结果显示，与对照组相比，10、20 μmol/L XN组细胞内Fe2+含量极显著升高（
P＜0.01），Fe 2 + 含量随XN浓度增加呈上升趋势（图4a）。FTH1是一种重要的储铁蛋白，主要功能是储存氧化还原失活的铁，并具有铁氧化酶活性，能催化Fe 2 + 氧化成Fe 3 + ，可以阻止Fe 2 + 介导的芬顿反应导致脂质过氧化物的产生以及对细胞造成不可逆的损伤。如图4b所示，与对照组相比，尽管10 μmol/L XN组FTH1表达量差异不显著，但是20 μmol/L XN组FTH1蛋白的表达量显著低于对照组（
P＜0.05），因此，XN可能通过诱发SKN-SH细胞内Fe 2 + 超载，最终导致细胞铁死亡。
05
铁死亡抑制剂对细胞活力的影响
为了验证XN是否诱导SK-N-SH细胞发生铁死亡，使用铁死亡特异性抑制剂Fer-1进行深入研究。使用特异性铁死亡抑制剂Fer-1（5 μmol/L）处理含与不含20 μmol/L XN培养基的SK-N-SH细胞后，采用SRB法检测细胞存活率，台盼蓝拒染法测定细胞死亡率，LDH试剂盒测试细胞膜损伤情况。结果发现，XN对SK-N-SH细胞增殖的抑制作用可被Fer-1缓解（图5a、b），并且对XN所致的细胞膜损伤具有保护作用（图5c）。
06
铁死亡抑制剂对细胞氧化应激水平的影响
与仅XN处理组相比，Fer-1与XN共处理组中，细胞内总ROS含量明显降低（图6a），脂质MDA、ROS水平显著降低（图6b、c）（
P＜0.05、
P＜0.01）。因此ROS在XN导致SK-N-SH细胞氧化应激过程中发挥了重要作用。
07
铁死亡抑制剂对细胞Fe2+超载的影响
Fe2+在驱动铁死亡和脂质过氧化中起不可替代的作用，Fe2+的水平可以作为铁死亡检测的重要判定指标。进一步验证Fer-1对细胞内Fe2+含量的变化，结果如图7所示，与仅XN处理组相比，Fer-1与XN共处理组中，Fer-1可显著降低XN所致的细胞Fe2+超载的现象（
P＜0.01 ）。故XN可能通过诱导Fe 2 + 超载诱导SK-N-SH细胞脂质氧化应激，最终导致铁死亡。
07
XN是啤酒花提取的异戊烯基黄酮类的天然化合物，在啤酒中的质量浓度高达0.96 mg/L。XN具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抑菌和降脂等生物功能，其中抗肿瘤功效极为显著。儿童神经母细胞瘤极易转移且愈后极易复发，目前神经母细胞瘤的治疗方法主要有放射治疗和化学药物治疗，都伴随一定的副作用。铁死亡是被Stockwell团队首次发现的新型细胞死亡方式，近年来备受关注，它是一种在细胞形态、代谢等方面与细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬等不同的铁依赖性的细胞死亡方式，主要由铁或酶介导的脂质过氧化引起细胞发生死亡。其发生的过程由ROS产生、Fe2+超载、脂质过氧化、质膜受损等系列生物事件组成。其中，细胞膜的氧化损伤是铁死亡发生的核心过程，对细胞存亡起决定性作用，近年来铁死亡作为研究热点在抗肿瘤领域关注度也日益增多。有研究表明XN可以逆转GPX4和溶质载体家族7成员11的下调，改善APAP和erastin诱导的肝铁死亡和肝细胞损伤，通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路发挥抗氧化应激和抗铁死亡作用，通过激活蛋白激酶B/糖原合酶激酶3β/核因子E2相关因子2通路改善铁过载引起的骨质流失，说明XN发挥作用的机制与Fe2+密切相关。
多项研究表明ROS在天然化合物抗肿瘤中发挥重要的作用，本研究以SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞为体外细胞模型，通过免疫荧光技术结合流式细胞术检测XN对SK-N-SH细胞的杀伤作用，并且从脂质氧化应激及氧化还原稳态平衡角度初步探索细胞的死亡方式及其潜在的相关机制。
本研究确定XN处理时间与浓度后，进一步研究发现，XN对SK-N-SH细胞具有显著的杀伤作用，其杀伤效果呈浓度和时间依赖性，且未产生耐药性，通过细胞形态学和培养液中LDH释放的检测，证明XN对SK-N-SH细胞膜具有损伤作用，使细胞处于一种严重受损的状态，并导致细胞死亡。
氧化还原稳态是细胞生物信息传导及细胞生长所必需的，生物膜上的脂质成分主要有甘油磷脂、鞘磷脂和胆固醇等，脂质过氧化是由自由基参与形成的一种氧化反应，主要发生在细胞膜和细胞器表面，鉴于XN对SK-N-SH细胞形态及细胞膜的损伤，初步判断细胞处在一个氧化应激的状态，因此进一步探讨XN处理后细胞ROS及脂质氧化应激的水平。实验结果显示，XN处理后ROS、脂质过氧化产物MDA水平均呈现上升趋势，细胞处在氧化应激受损的状态，为对其氧化应激原因进行深入探究，进一步检测细胞氧化防御能力。
G6PDH、NADPH、GSH在保持氧化还原稳态方面具有重要作用，GSH作为GPX4的作用底物能够将膜脂质过氧化物转化为没有毒性的脂质醇，对维持细胞膜的脂质双分子层稳定起重要作用。在实验结果中，SK-N-SH细胞经XN处理后，胞内G6PDH、NADPH、GSH水平显著降低，特异性膜脂过氧化清除酶GPX4蛋白表达也显著降低。细胞中GSH合成受阻，会导致GPX4活性下降，最终脂质过氧化物不能及时修复清除导致在细胞内积聚，这也进一步证明细胞膜损伤的结论。所以，XN诱导SKN-SH细胞氧化还原稳态失衡，其中包含较为显著的脂质过氧化应激水平升高以及脂质过氧化防御能力降低。
GPX4也是铁死亡的中心调节因子，结合铁死亡是由铁或酶介导的脂质过氧化引起细胞死亡的特点，初步判断XN可能诱导SK-N-SH细胞发生铁死亡。Fe2+以游离不稳定形式存在于细胞中，与低分子质量化合物结合，包括GSH，GSH的耗竭不仅能使GPX4失活，还能动员Fe2+进行芬顿化学反应，促进脂质过氧化物产生，最终导致细胞铁死亡。因此，本实验对XN诱导SK-N-SH细胞死亡的具体方式进行深入探究。结果发现，Fe2+含量随XN浓度增加呈现上升趋势，胞内出现Fe2+过载现象。铁蛋白是细胞内铁储存蛋白，由FTH1和铁蛋白轻链两种亚基组成，其中FTH1包含一个铁氧化酶活性位点（功能性组成），可以将Fe2+氧化成Fe3+储存在铁蛋白中央，对维持铁稳态起着至关重要的作用。若FTH1表达受到抑制，细胞内多余的Fe2+无法被捕获，亦会加剧细胞内的芬顿反应，进而产生大量的脂质过氧化物堆积。本实验结果表明，FTH1蛋白的表达随XN浓度升高显著降低，故XN诱导SK-N-SH细胞Fe2+超载，其潜在及机制可能与FTH1蛋白表达降低有关。此外，Fer-1被认为是铁死亡的特异性抑制剂，为了验证XN是否诱导SK-N-SH细胞发生铁死亡，本研究引入铁死亡特异性抑制剂Fer-1进行深入探索。结果发现Fer-1对细胞增殖抑制及损伤状态起到显著的保护作用，可减轻胞内ROS及脂质氧化应激，Fe2+过载状态亦被减轻，这进一步证实XN诱导SK-N-SH细胞发生铁死亡。
07
结论
综上所述，体外细胞实验结果显示XN抑制SK-N-SH细胞增殖并致其死亡，其机制可能是XN诱导SK-N-SH细胞氧化还原稳态失调，触发Fe2+过载和脂质过氧化应激诱导细胞发生铁死亡，其可能机制如图8所示。
作者简介
通信作者：
许 波 副教授
烟台大学生命科学学院
1、主要教学、科研项目
（1）参与山东省科技攻关项目“黄海养殖真海鞘降血糖物质基础的确定”
（2）主持烟台市科技发展计划项目“海参加工废水的开发利用”
（3）主持山东省自然科学基金项目“大芸皂苷类成分分离及其抗氧化、抗
衰老作用研究”
（4）主持山东省中青年科学及科研奖励基金项目“黄海玻璃海鞘脂溶性提
取物的分离纯化及抗肿瘤活性研究”
2、荣誉奖励
山东省科技进步三等奖：海洋微藻的高密度培养技术研究。
3个人经历
（1）1989.09–1993.07，烟台大学化学生物理工学院 本科；
（2）2003.09–2006.07，中国海洋大学 博士研究生；
（3）2003.07至今，烟台大学 教师。
4、研究方向
食品功能因子开发及利用。
第一作者：
褚红丹 硕士研究生
烟台大学生命科学学院
1、个人经历
（1）2019年9月-2023年7月，烟台大学生命科学学院 大学本科；
（2）2023年至今，烟台大学生命科学学院 研究生在读。
2、研究方向
天然生物活性物质筛选
3、荣誉奖励
烟台大学“国家励志奖学金”
烟台大学“优秀共青团员”
第十四届山东省大学生科技节食品加工与安全创新设计大赛三等奖
烟台大学“优秀毕业生”
本文《黄腐酚诱导SK-N-SH人神经母细胞瘤铁死亡的作用机制》来源于《食品科学》2025年46卷第17期170-179页，作者：褚红丹，王振华，王 凡，梁 正，贺红军*，许 波*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250112-084。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：梁雯菁；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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