Nat Biotechnol. | 韩国科学家借助高通量筛选发现病毒元件可作为mRNA疫苗稳定性增强剂

在mRNA技术迅猛发展的今天，一项来自韩国首尔国立大学的研究成果，正为疫苗和治疗药物注入新活力。2025年11月7号，《Nature Biotechnology》杂志在线发表了由金恩姬（V. Narry Kim）教授领导的团队论文，他们通过大规模病毒序列筛选，识别出11种新型RNA稳定性增强剂。这些元素能显著延长mRNA在体内的寿命，同时提升蛋白翻译效率，尤其适用于碱基修饰的mRNA疗法。这项发现有望解决mRNA疫苗稳定性不足的痛点，推动更耐用、低免疫原性的药物开发。

mRNA技术自新冠疫苗问世以来，已革命性地改变了疫苗和治疗领域。但其核心挑战在于mRNA在体内的稳定性有限，一旦进入细胞质，mRNA易被快速降解，导致蛋白产生短暂且不充分。传统线性mRNA通过体外转录合成，带有5'端帽和poly(A)尾巴，并常使用假尿苷（Ψ）、N1-甲基假尿苷（m1Ψ）等修饰碱基来降低双链RNA副产物，减少免疫激活。然而，这些修饰虽能抑制免疫传感器如蛋白激酶R和TRIM25，但无法有效对抗去腺苷化过程——这是mRNA降解的限速步骤，由CCR4-NOT复合物主导，导致poly(A)尾巴缩短，最终引发尿苷化和脱帽降解。现有替代方案如环状RNA（circRNA）或自扩增RNA（saRNA）虽更耐用，但面临翻译效率低、修饰不兼容或制造复杂等问题，限制了临床应用。

为克服这些局限，研究团队从病毒中寻找灵感。病毒作为进化高手，常利用宿主机制稳定自身RNA。他们编译了337种病毒物种、297个属的基因组序列，总计196,277个197核苷酸的平铺片段，构建了一个覆盖七大巴尔的摩分类系统的病毒库。这远超以往筛选的广度和深度，包括双链DNA病毒如疱疹病毒，以及单链RNA病毒如皮科纳病毒。初筛阶段，他们将这些片段插入增强绿色荧光蛋白（EGFP）的3'非翻译区（UTR），整合到HEK293T细胞中，通过荧光激活细胞分选（FACS）富集高表达细胞，获得10,784个潜在增强剂。次筛则聚焦m1Ψ修饰mRNA，使用脂质纳米颗粒（LNP）递送荧光素酶报告mRNA到HCT116细胞，比较转染后0小时和36小时的RNA丰度，量化稳定性提升。

筛选结果：131个片段显著增强m1Ψ-mRNA稳定性（调整P<0.001，对数2倍变>0.4），聚集成11个集群（A1至A11），源自不同病毒家族，如疱疹病毒科的HCMV（A1）、乙肝病毒科的HBV（A4）和皮科纳病毒科的HAV（A6）。这些元素机制上通过招募末端核苷酸转移酶TENT4（TENT4A/B）延长poly(A)尾巴，形成“混合尾巴”（主要腺苷偶掺非腺苷），有效抵抗CCR4-NOT的去腺苷化。其中，10个元素共享CNGG环状结构（如CNGGN五元环），A7则独树一帜，采用分支茎环结构。验证实验显示，所有元素在未修饰mRNA中均强劲提升荧光素酶表达，但仅A1、A2、A4、A6和A7在m1Ψ-mRNA中保留60%以上活性，证明其修饰兼容性。短版构造（如A7S，155nt）往往更高效，暗示核心功能区精简。

特别值得一提的是A7元素，源自皮科纳病毒科的Melegrivirus A。它在多种细胞类型、递送方式和编码序列中均表现出色。通过深度诱变分析，团队揭示A7的结构特征：一个带凸起的茎（S1）连接内部环（IL），分支出两个小茎环（SL1和SL2）。关键基序包括IL中的“AGACCY”（Y为嘧啶）和SL2中的“GGGGNARUD”（R为嘌呤，D非C），这些区域对稳定性至关重要。不同于其他元素依赖CNGG环招募TENT4共因子ZCCHC14，A7可能通过独特机制实现尾巴延长。在HCT116细胞中，A7-m1Ψ-mRNA的蛋白输出比对照高出30倍以上，且持续时间长达5天以上，远超商业疫苗UTR如mRNA-1273和BNT162b2。

体内实验进一步验证了A7的潜力。在小鼠肝脏模型中，A7线性mRNA的蛋白水平显著高于环状RNA，且表达持续超过2周，而环状RNA虽稳定但翻译效率低。A7还兼容多种碱基修饰，降低免疫原性：它抑制了干扰素产生和炎症细胞因子响应，使mRNA更安全。研究显示，A7在脂质体或LNP递送下均有效，且适用于不同编码序列，如荧光素酶或绿色荧光蛋白。这使得线性mRNA平台结合了高表达、耐用性和简单制造的优势，避免了环状RNA的环化复杂性和saRNA的dsRNA免疫风险。

这项发现为mRNA疗法开辟新路径。传统mRNA疫苗如新冠疫苗虽快速响应，但疗效短暂；如今，融入这些稳定性增强剂的线性mRNA，可实现持久蛋白产生，适用于慢性病治疗、基因编辑或癌症免疫疗法。团队强调，这些元素源自自然病毒，结构紧凑，便于大规模生产，且无明显毒性。未来，通过优化组合或与CRISPR等技术整合，可进一步提升疗效。