南京中医药大学&中科院以蛋白组学揭示芪参益气丸通过抑制线粒体分裂改善缺血心力衰竭

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导读

背景：芪参益气丸（QSYQ）已广泛应用于心血管疾病的临床治疗，但其疗效背后的确切机制仍需进一步探究。

目的：本研究旨在从蛋白质组学的角度探讨QSYQ治疗缺血性心力衰竭的潜在机制。

方法：在体内实验中，通过分析心脏功能和心脏重构情况，观察QSYQ对缺血性心力衰竭进展的影响。采用小鼠心脏组织进行基于串联质谱标签（TMT）的蛋白质组学分析。制备心肌细胞，并对其建立氧糖剥夺损伤，测定QSYQ对差异蛋白表达、线粒体分裂和线粒体功能的影响。

结果：QSYQ治疗可维持心肌缺血后小鼠的心脏功能，限制心脏纤维化，并减轻心肌细胞肥大。蛋白质组学分析显示，QSYQ调控蛋白主要参与线粒体分裂，包括线粒体钙单转运蛋白（MCU）、膜相关RING-CH型指状蛋白5（MARCHF5）和线粒体分裂蛋白1（MTFP1）。蛋白质相互作用分析表明，MCU、MARCHF5和MTFP1均与动力蛋白相关蛋白1（DRP1）存在相互作用。敲低MCU、MARCHF5或MTFP1可通过调节DRP1的磷酸化及其向线粒体的转运，减轻心肌细胞中过度的线粒体分裂。QSYQ通过下调这三种差异蛋白，降低了DRP1在Ser616位点的磷酸化水平，增强了其在Ser637位点的抑制性磷酸化，并减少了DRP1的线粒体募集和寡聚化化。因此，QSYQ能有效抑制异常线粒体分裂，改善线粒体功能障碍，从而保护心肌细胞免受缺血损伤。

结论：本研究的创新点在于通过蛋白质组学揭示了QSYQ的作用机制，发现其通过抑制MCU/MARCHF5/MTFP1-DRP1介导的线粒体分裂，缓解缺血性心力衰竭。

论文ID

原名：Proteomic analysis reveals QiShenYiQi Pills ameliorates ischemia-induced heart failure through inhibition of mitochondrial fission

译名：蛋白质组学分析显示芪参益气丸通过抑制线粒体分裂改善缺血心力衰竭

期刊：Phytomedicine

IF：8.3

发表时间：2025.1

通讯作者：唐宗湘、 李佳 ， 尹小建

通讯作者单位：南京中医药大学， 中国科学院东北地理与农业生态研究所

DOI：10.1016/j.phymed.2025.156435

实验设计

实验结果

1.QSYQ的化学组成分析

采用UPLC-Q-TOF-MS对QSYQ提取物进行了化学表征。图1显示了在正离子和负离子模式下检测到提取物的代表性总离子流色谱图。共鉴定出33种化学成分，负离子模式下检测到24 种，正离子模式下检测到 9 种。结合质谱（MS）和二级质谱（MS/MS）碎片模式，通过检索相关数据库及文献，对这些成分进行了初步鉴定，详细信息见表S3。这些成分主要包括12种皂苷、11种酚酸、5种萜类、3种异黄酮、1种黄酮和1种其他化合物。

图1芪参益气丸的化学成分。通过UPLC-Q-TOF-MS在正离子和负离子模式下分析的QSYQ提取物的代表性总离子色谱图（TIC）。

2.QSYQ对心肌梗死后小鼠的心脏保护作用

为观察QSYQ对心力衰竭进展的作用，在心肌梗死4周后，研究人员对小鼠的心功能和心力衰竭指标进行了测定，以曲美他嗪为阳性对照。超声心动图结果显示，每天服用QSYQ可改善缺血性损伤后的心功能，射血分数（EF%）和缩短分数（FS%）升高，以及左心室舒张末期容积（LV vol;d）和收缩末期容积（LV vol;s）降低（图2A）。此外，QSYQ或曲美他嗪处理显著降低了血清中N 末端 B 型脑钠肽前体（NT-pro-BNP）水平的升高（图S2A）。Masson三色染色显示，QSYQ以及曲美他嗪减轻了心肌梗死后小鼠的心脏纤维化（图2B）。与此一致地，研究者观察到心肌纤维化标志物Ⅰ型胶原 α1 链（COL1A1）和 Ⅲ 型胶原α1 链（COL3A1）的表达在缺血心脏中显著增加，并且通过服用QSYQ或曲美他嗪可逆转这一变化（图2C&D）。麦胚凝集素（WGA）染色显示，心肌梗死后小鼠心脏的心肌细胞体积增大，QSYQ或曲美他嗪处理可阻断这一现象（图2E）。这些结果表明，QSYQ在缺血性心力衰竭发展过程中对心脏重塑和功能障碍具有保护作用。

图2 QSYQ对心肌梗死后小鼠的心脏保护作用。小鼠接受了左前降支冠状动脉的永久结扎，然后每天服用不同剂量（17.5mg/kg、35mg/kg或70mg/kg）的QSYQ或曲美他嗪（20mg/kg），持续4周。A：通过超声心动图和小鼠心脏功能参数（n=6）获得的代表性M型图像。B：心肌梗死后小鼠心脏的Masson三色染色（条形：1mm（左）和500μm（右）；n=6）。C&D：1型胶原和3型胶原的水平（柱状图：50μm，n=6）。E：小麦胚芽凝集素（WGA）染色（条：50μm，n=6）。数据以平均值±标准差表示。与心肌梗死组相比，*p<0.05；与假手术组相比，#p<0.05。EF：射血分数；FS：分数缩短；LVvol；d：左心室舒张末期容积；LVvol；s：左心室收缩末期容积；MI，心肌梗死；QSYQ，芪参益气；TMZ，曲美他嗪。

3.心肌梗死小鼠心脏组织的蛋白质组学分析

为鉴定QSYQ调控心脏重塑和功能障碍的潜在蛋白，研究者采用蛋白质组学方技术进行分析（图3A）。基于合格数据（图S3A-D），共鉴定出36834 条肽段，对应 4578 种蛋白（图3B&C）。其中，与假手术组相比，心肌梗死后小鼠心脏组织中125种蛋白质上调，97种蛋白质下调（图3B&C，表S4）。对鉴定蛋白的PCA分析显示，心肌梗死（MI）组和假手术组之间存在明显分离，在OSYQ处理后观察到蛋白质模式出现一定程度的逆转（图3D）。KEGG富集分析表明，心肌梗死相关差异蛋白主要与扩张型心肌病、心肌肥厚等通路相关（图3E）。

图3 心肌梗死后小鼠心脏组织的蛋白质组学分析。A：基于TMT的蛋白质组学分析实验方法流程图。B：从心肌梗死（MI）和假手术组的比较中鉴定出差异表达的蛋白质。C：火山图显示蛋白质发生了显著变化。D：基于已鉴定的蛋白质（n=3）对假手术组（sham）、心肌梗死（MI）和MI加QSYQ处理组（MI+QSYQ）进行主成分分析（PCA）。E：KEGG富集通路分析。MI，心肌梗死；QSYQ，芪参益气丸。

根据假手术组、心肌梗死组和心肌梗死+QSYQ处理组的变化趋势，将这些心肌梗死反应蛋白分为4类（图4A）。QSYQ处理对聚类1和聚类3中的蛋白质没有显著影响。聚类2中的蛋白在MI组中显著升高，但在QSYQ处理后降低。聚类4 中的蛋白在MI组中下调，但QSYQ处理后明显上调（图4A）。根据变化趋势，聚类2和聚类4中的蛋白质被鉴定为QSYQ改善或调控蛋白。GO富集分析表明，这些蛋白质位于线粒体中，主要参与线粒体组装和线粒体分裂（图4B）。Cnet图分析表明，线粒体分裂、线粒体组装等富集的GO 术语形成环形网络（图4C）。考虑到线粒体分裂是缺血性心脏损伤的重要致病因素，研究发现，参与线粒体分裂通路的三种蛋白：线粒体钙单向转运蛋白（MCU）、膜相关RING-CH 型指状蛋白 5（MARCHF5）和线粒体分裂蛋白1（MTFP1）在心肌梗死小鼠心脏中显著上调，但QSYQ处理可逆转这一变化（图4D），提示这三种蛋白质可能是QSYQ的潜在靶点。

图4 通过生物信息学分析对蛋白质组数据进行功能分类。A：基于其变化趋势，对假手术组（sham）、心肌梗死（MI）和MI加QSYQ处理组（MI+QSYQ）中显著变化的蛋白质进行聚类分析。位于聚类2和4中的蛋白质被认为是由QSYQ恢复或调节的。B：使用基因本体（GO）数据库对QSYQ改善或调节的蛋白质进行功能分类。C：Cnet图描绘了富集GO术语之间的关联。D：调节线粒体分裂的蛋白质热图。QSYQ，芪参益气丸。

4.QSYQ对MCU、MARCHF5和MTFP1表达的影响验证

通过蛋白质印迹实验进一步验证蛋白质组学分析鉴定出的三种关键蛋白的表达。结果显示，心肌梗死小鼠心脏组织中MCU、MARCHF5和MTFP1的蛋白水平显著升高，而给予QSYQ可在很大程度上逆转这一变化（图5A-C）。在细胞水平上，研究者通过建立原代心肌细胞氧糖剥夺（OGD）损伤模型，进一步验证了这三种蛋白的表达，证实了QSYQ这些蛋白具有抑制作用（图5D-F）。

图5 验证QSYQ对差异表达蛋白的影响。A-C：小鼠接受了左前降支冠状动脉的永久结扎，然后每天服用QSYQ（35mg/kg），持续4周。免疫印迹分析检测心肌梗死后小鼠心脏线粒体钙单向转运蛋白（MCU）、膜相关RING-CH 型指状蛋白 5（MARCHF5）和线粒体分裂1（MTFP1）的蛋白表达（n=4）。D-F：制备原代心肌细胞，并在有或没有QSYQ处理（1 mg/mL）的情况下进行氧糖剥夺（OGD）。免疫印迹检测MCU、MARCHF5和MTFP1的蛋白水平（n=4）。数据以平均值±标准差表示。MI，心肌梗死；QSYQ，芪参益气丸。

5.敲低MCU、MARCHF5或MTFP1可减轻DRP1介导的线粒体分裂

STRING蛋白相互作用分析显示，动力蛋白1 样蛋白（DNM1L，又称DRP1），是与MCU、MARCHF5和MTFP1具有功能相关性的常见靶蛋白（图6A）。OGD损伤促进了心肌细胞中DRP1在Ser616位点的磷酸化，并抑制其在Ser637 位点的磷酸化，以激活心肌细胞中的DRP1，而这种改变可被敲低Mcu所逆转（图6B，图S4A）。免疫荧光检测显示，激活的DRP1 会向线粒体转运；敲低Marchf5 可通过调控 DRP1 的磷酸化使其失活，进而减少 DRP1 向线粒体的募集（图6C&D，图S4B）。募集的DRP1会导致线粒体过度分裂，而在OGD损伤下，敲低Marchf5的心肌细胞中这一现象受到抑制（图6E）。同样，敲低Mtfp1也可通过降低DRP1在Ser616位点的磷酸化水平，提高其在Ser637位点的去磷酸化水平来抑制OGD处理的心肌细胞中DRP1介导的线粒体分裂（图6F&G，图S4C）。此外，参与线粒体融合的线粒体融合蛋白2（MFN2）的水平在OGD损伤后下调，而敲低Mcu、Marchf5或Mtpf1的未能逆转这一变化（图S5A-C）。

图6敲低差异表达的蛋白质减弱了DRP1介导的线粒体分裂。A：STRING数据库预测的蛋白质相互作用网络。B&C：通过免疫印迹检测转染Mcu或Marchf5 siRNA的心肌细胞中DRP1的磷酸化（n=4）。D：DRP1在转染Marchf5-siRNA的心肌细胞线粒体中的募集（n=4）。bar：10μm。E：转染Marchf5 siRNA的心肌细胞线粒体形态的视图和定量（n=4，上图，比例尺：10μm；下图，放大图像，比例尺：5μm）。F：免疫印迹检测转染Mtfp1-siRNA的心肌细胞中DRP1的磷酸化（n=4）；G：分别转染Mtfp1-siRNA的心肌细胞线粒体形态的观察和定量（n=4，上图，比例尺：10μm；下图，放大图像，比例尺：5μm）。数据以平均值±标准差表示。OGD，氧糖剥夺。

6. QSYQ抑制DRP1介导的线粒体分裂

本研究观察了QSYQ对DRP1修饰和线粒体形态变化的影响。结果显示，QSYQ处理可降低OGD损伤下DRP1在Ser616位点的磷酸化水平（图7A），并增强其在Ser637位点的磷酸化水平（图7B）。随后，蛋白质印迹和免疫荧光分析均证实，QSYQ可减少胞质中DRP1 向线粒体的转运（图7C&D）。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察到，OGD损伤会增加DRP1 的寡聚化，QSYQ处理可抑制这一现象（图7E）。类似地，QSYQ处理降低了心肌梗死小鼠心脏中DRP1的寡聚化（图7F）。QSYQ可以防止OGD诱导的心肌细胞线粒体过度断裂，这可以通过Mito Tracker Red染色来证明（图7G）。此外，透射电镜观察显示，OGD损伤下的心肌细胞中，线粒体肿胀、形态变圆，嵴断裂并出现空泡化，表明线粒体分裂增加。而QSYQ处理逆转了这一变化，表现为线粒体形态更细长，嵴结构完整（图7H）。

图7 QSYQ抑制DRP1介导的线粒体分裂。A&B：在接受OGD损伤的心肌细胞中，无论是否接受QSYQ处理，通过蛋白质印迹检测到DRP1的磷酸化（n=4）。C：DRP1在线粒体部分和细胞质部分的表达（n=4）。D：在QSYQ给药存在或不存在的情况下，经OGD损伤的心肌细胞中DRP1易位到线粒体（n=4，bar:10μm）。E：在天然条件下，在接受OGD损伤的心肌细胞中测量DRP1寡聚化（DRP1-o），有或没有QSYQ给药（n=4）。F：心肌梗死后小鼠心脏中DRP1的寡聚状态（n=4）。G：在有或没有QSYQ的情况下，心肌细胞线粒体形态对OGD损伤的反应视图和量化（n=4，上图，比例尺：10μm；下图，放大图像，比例尺：5μm）。H： 经或不经QSYQ处理的OGD损伤的心肌细胞线粒体的透射电镜图像（绿色箭头：正常和细长的线粒体；红色箭头：受损和破碎的线粒体。比例尺：左侧2µm，右侧1µm）。数据以平均值±标准差表示。OGD，氧糖剥夺；QSYQ，芪参益气丸。

7. QSYQ通过减轻线粒体功能障碍保护心肌细胞免受缺血性损伤

接下来，进一步研究QSYQ对线粒体完整性受损相关功能后果的调节作用。结果显示，OGD损伤后导致线粒体ROS生成增加（图8A），同时伴有线粒体钙超载（图8B）。OGD损伤导致线粒体膜电位崩溃（图8C），加速MPTP的开放（图8D），且ATP含量显著降低（图8E）。TUNEL染色观察到心肌细胞凋亡增加（图8F）。这一过程还伴随着线粒体凋亡通路的激活，表现为Bax和Bak表达上调和Bcl2表达下调（图8G）。然而，QSYQ处理逆转了这些改变（图8A-G），表明其在改善线粒体功能和保护心肌细胞的作用（图8H）。在体内实验中，QSYQ处理也可防止心肌梗死小鼠心脏的线粒体肿胀（图8I）。

图8 QSYQ通过减轻线粒体功能障碍保护心肌细胞免受缺血性损伤。A-H：心肌细胞受到OGD损伤，有或没有QSYQ处理。线粒体ROS产生（A，n=6）、线粒体钙含量（B，n=6）、线粒体电位（C，n=4，bar:20μm），测量线粒体通透性转换孔的开口（D，n=4，bar:10μm）、ATP含量（E，n=6）、TUNEL染色（F，n=4）、Bax、Bak和Bcl2的蛋白水平（G，n=4）和细胞存活率（H，n=6）。I：透射电镜观察心肌梗死小鼠心脏线粒体结构。线粒体形态通过纵横比分析进行评估。比例尺，200 nm。数据以平均值±标准差表示。MI，心肌梗死；OGD，氧糖剥夺；QSYQ，芪参益气丸。

本研究观察到QSYQ对缺血诱导的心力衰竭中心脏重塑和功能障碍具有保护作用。基于TMT的蛋白质组学揭示，线粒体组织和分裂相关蛋白，包括MCU、MARCHF5和MTFP1，是QSYQ的潜在靶点。生物信息学表明，DRP1是这三种差异蛋白的共同下游蛋白。MCU、MARCHF5或MTFP1的敲低通过调节DRP1磷酸化及其向线粒体的转运来减轻缺血条件下过度的线粒体分裂。QSYQ处理下调了MCU、MARCHF5或MTFP1的水平，随后抑制了DRP1介导的线粒体分裂，保护心肌细胞免受缺血性损伤。结果表明，QSYQ通过抑制MCU/MARCHF5/MTFP1-DRP1介导的线粒体分裂和线粒体功能障碍来缓解缺血性心力衰竭（图9）。

心肌梗死可导致病理性心室重构，最终导致心力衰竭，表现为心肌细胞损失和纤维化的典型症状。为此，心脏重塑和心力衰竭的治疗可以聚焦于心肌细胞保护和纤维化抑制。以往的临床和实验研究表明，QSYQ具有心脏保护活性。据报道，QSYQ可以减轻心脏成纤维细胞的反应性心肌纤维化，从而限制左心室重构。心肌梗死后，衰竭的心脏会发生大规模持续的心肌细胞死亡，导致心脏功能障碍，成年心肌细胞缺乏再生能力。因此，抑制心肌细胞凋亡是预防缺血性心力衰竭的一种潜在策略。据报道，QSYQ可参与抑制心肌细胞凋亡。与此一致，本研究证实，QSYQ可以通过减轻心肌细胞凋亡、提高心肌细胞在缺血损伤下的存活率，来减轻心脏重塑和功能障碍。为了进一步研究其潜在机制，以心肌组织（主要是心肌细胞）为样本进行蛋白质组学分析。

线粒体损伤和功能障碍是缺血性心力衰竭的病理事件，这被归类为一种生物能量疾病。在衰竭的心脏中，线粒体异常，其特征是线粒体OXPHOS功能受损、ROS产生过量和线粒体形态异常，导致心肌细胞过度死亡，最终导致不可逆的心脏功能障碍。因此，靶向心肌细胞线粒体功能障碍具有治疗心力衰竭的潜力。在本研究中，蛋白质组学分析表明，与线粒体结构和功能相关的差异蛋白MCU、MARCHF5和MTFP1可能是QSYQ调控的靶蛋白。其他的体外和体内实验证实了QSYQ在改善线粒体功能方面的影响，表现为减少ROS产生和线粒体钙超载、阻断MPTP开放和线粒体肿胀。因此，QSYQ处理促进了心肌细胞的存活，改善了长期缺血性损伤下的心脏功能。本研究结果与多项研究结论一致，这些研究均表明QSYQ具有调节线粒体功能以限制急性缺血性损伤的能力。

MCU是介导钙离子从细胞质流入线粒体基质的通道蛋白，被认为是线粒体疾病（如缺血和心力衰竭）的潜在参与者。在病理性心脏重塑过程中，MCU的蛋白质水平升高，导致线粒体钙离子超载，导致线粒体功能障碍、通透性转换和细胞死亡。与此一致，本研究观察到心肌梗死小鼠心脏中MCU表达显著升高。线粒体钙离子信号可通过影响DRP1的磷酸化来调节线粒体分裂。在本研究中，敲低Mcu可通过抑制DRP1 在 Ser616 位点的磷酸化、促进其在 Ser637 位点的磷酸化，减轻氧糖剥夺处理的心肌细胞中 DRP1 的激活。近期研究表明，位于线粒体中的E3泛素连接酶MARCHF5与缺血性心脏病有关。据报道，MARCHF5以依赖DRP1的方式参与线粒体分裂的调节。作为线粒体分裂的促进因子，MARCHF5已被证实参与调节DRP1亚细胞运输以促进其向线粒体的转运。一致地，研究者发现敲低Marchf5会减弱OGD损伤后心肌细胞中DRP1向线粒体的募集，这表明该蛋白可能是药物干预的潜在靶点。另一种受QSYQ调节的差异蛋白MTFP1是一种线粒体内膜蛋白，与DRP1磷酸化状态和活性相关。有证据表明，在阿霉素诱导的心脏毒性中，MTFP1表达上调，敲低MTFP1可以通过阻止DRP1介导的线粒体分裂来减轻心肌细胞的损失。与此一致，本研究发现心肌梗死小鼠心脏中MTFP1的表达显著上调，而敲低Mtfp1的心肌细胞线粒体过度分裂受到抑制。因此，本研究强调，DRP1介导的线粒体分裂是QSYQ调节的这三种差异蛋白共同的下游通路。据此可合理推断，QSYQ通过下调MCU、MARCHF5和MTFP1的表达来抑制DRP1介导的线粒体分裂，从而发挥其心脏保护作用。

线粒体作为动态细胞器，其形态由融合和分裂两种相反的过程共同决定。融合和分裂对线粒体功能有多种影响，包括能量供应、ROS产生和细胞死亡。严格控制线粒体丰度和形态对于高度能量依赖的心肌细胞至关重要。MFN2是线粒体融合的关键介质。尽管有报道称MARCHF5和线粒体融合蛋白MFN2之间存在相互作用，但研究者观察到敲低MARCHF5对MFN2蛋白水平没有影响，这一发现与之前的研究一致。其他证据表明，MFN2与MCU的表达之间没有相关性。因此，本研究主要关注在线粒体分裂过程中起作用的蛋白质的功能。向分裂的转变导致线粒体断裂和功能障碍，并激活凋亡信号通路以诱导心脏损伤，最终导致心力衰竭。DRP1是线粒体分裂的发起者，最初位于细胞质中，但在激活后会移动到线粒体外膜。DRP1在线粒体上寡聚形成环状结构以分裂线粒体。其线粒体募集受磷酸化修饰的控制。特别是，DRP1在Ser 616的磷酸化可以诱导其从细胞质迁移到线粒体并随后发生线粒体断裂，而其在Ser 637的磷酸化则抑制其募集。在本研究中，OGD损伤通过调节DRP1的磷酸化和转运，导致心肌细胞线粒体异常断裂，而敲低Mcu、Marchf5或Mtfp1可逆转这一变化。由于降低了这三种差异蛋白的丰度，QSYQ通过调节DRP1的磷酸化来减轻DRP1的线粒体的转运，从而减轻了线粒体过度分裂对缺血性损伤的影响。尽管之前的一项研究也表明了QSYQ在改善线粒体动态稳态中的作用，但本研究从蛋白质组学的角度强调了QSYK保护线粒体结构和功能的潜在靶点和潜在机制。这些结果证实了QSYQ的心脏保护作用，并证明MCU/MARCHF5/MTFP1-DRP1介导的线粒体分裂是QSYQ改善缺血性心力衰竭的潜在通路。

图9 芪参益气丸抗缺血性心力衰竭心脏保护作用的机制通路。蛋白质组学分析发现，MCU、MARCHF5和MTFP1是QSYQ在心肌缺血后小鼠心脏中的靶蛋白。这三种蛋白质在缺血损伤后显著升高，通过增加DRP1在Ser616的磷酸化和减少其在Ser637的磷酸化来促进DRP1的线粒体募集和寡聚化，随后诱导异常线粒体分裂和心脏功能障碍。QSYQ治疗通过抑制MCU/MARCHF5/MTFP1-DRP1介导的线粒体分裂、线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡来减轻缺血诱导的心脏重塑和功能障碍。DRP1，dynamin相关蛋白1；MARCHF5，E3泛素蛋白连接酶；MCU，线粒体钙单转运蛋白；MTFP1，线粒体分裂过程1；QSYQ，芪参益气丸。

结论

总之，本研究使用基于TMT的蛋白质组学技术，系统鉴定了QSYQ在小鼠心脏中调控的蛋白。QSYQ通过抑制MCU/MARCHF5/MTFP1-DRP1介导的线粒体分裂来改善缺血性心力衰竭。本研究为芪参益气丸在心力衰竭临床治疗中的应用提供了依据，并通过蛋白质组学的视角对这种疗效潜在机制提供了新的见解。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711325000765

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