荧光原位杂交（FISH）实验常见问题

一、荧光原位杂交的定义

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种利用荧光标记的核酸探针，与细胞或组织样本中互补的核酸序列在原位进行特异性杂交，从而通过荧光显微镜对特定基因或染色体区域进行定位、定性和相对定量的技术。

二、荧光原位杂交的分类

细说的话，荧光原位杂交实验也有直接法与间接法之分，其应用都十分广泛。

直接法即是直接使用荧光标记的核酸探针进行FISH实验，杂交后便可观察荧光来判断结果；

间接法则是先使用地高辛/生物素标记探针进行杂交，再进一步使用亲和素或地高辛抗体标记荧光素使探针再带上荧光标记，如此一来即可实现荧光原位杂交，并且该种方法具有级联效应，可以将杂交信号二次放大，具备更高的检测灵敏度。另外，想要检测多个基因，该种方法相比于直接法会更加合适，原因是亲和素标记的荧光素种类比能直接标记到探针上的荧光素种类要更多，因此研究者拥有更加灵活的选择空间，Fish实验整体的灵敏度也能得到提升。目前，市场上做该类型Fish实验的试剂盒品牌只在极少数，研究者可优先选择像百代生物这样的龙头企业品牌，产品性能更有保证，并且使用该试剂盒，研究者可省去繁琐的预杂交步骤，实验流程更简便的同时实验效率也能得到显著提升。

三、荧光原位杂交实验常见问题

1.荧光原位杂交实验中，荧光标记探针的长度和浓度分别为多少合适？

标记探针的长度不宜过大，以150-350bp/nt 为宜，片段过长易导致非特异杂交；片段短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短，但片段过短往往会降低检测灵敏度。

最适宜的探针浓度通常需通过实验才能确定，其在杂交工作液中的浓度范围一般为0.25-1μg/mL，研究者可以按照0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL来进行优化。

2.背景荧光过高（非特异性斑点或弥漫）？

可能原因有以下几点：

1）封片剂问题：封片剂含有荧光杂质或自身会产生荧光。

2）载玻片不洁：玻片上有灰尘或污染物。

3）探针降解或片段过小：产生非特异性结合。

4）杂交后洗涤不彻底。

解决方案：

1）使用高质量的封片剂：选择经过认证的无荧光封片剂。

2）确保玻片清洁：使用超纯水清洗或购买预清洁的玻片。

3）检查探针：避免探针反复冻融。

4）严格洗涤。

3.信号弱且背景高？

可能原因及建议如下:

（1）洗涤不充分:这是最常见的原因。未结合的探针或非特异性结合的探针未被洗掉。建议增加洗涤次数或延长洗涤时间。

（2）探针浓度过高:导致非特异性结合增加。建议进行探针浓度梯度实验，找到信比最佳的浓度。

（3）封闭不足:样本中某些成分与探针或检测试剂非特异性结合。建议调整封闭时间或选用纯化学成分，无任何蛋白成分的封闭液如BIOG核酸杂交化学快速封闭液II等，由于无抗原性，不会产生任何交叉反应，可应用于各种核酸杂交封闭场景。

（4）样本自身荧光:固定剂(如醛类)可能诱发自发荧光:红细胞内的血红素也有强自发荧光。建议用NaBH₄，处理样本以减少醛基引起的自发荧光:对于组织样本，充分灌注以去除红细胞。