细胞治疗背后的 “计数难题”：看似简单的数数，实则藏着大门道

摘要：细胞治疗作为当下热门的新型疗法，能利用活细胞修复患者体内受损细胞，像 CAR-T、干细胞治疗都已走进临床。但很多人不知道，“细胞计数”—— 也就是准确统计细胞数量和活性，是决定治疗效果的关键环节。本文就从细胞计数的重要性出发，拆解它面临的复杂挑战，介绍常用的计数方法，分享提升准确性的技巧，还揭秘了上市细胞治疗产品的计数标准，让大家看清这一看似简单的操作背后，藏着怎样的技术门道。

一、为啥细胞计数对细胞治疗这么重要？

提起细胞治疗，大家可能更关注 “哪些病能治”“效果好不好”，却很少留意 “细胞计数” 这个基础操作。可实际上，它就像细胞治疗的 “第一道质量关”，少了它，治疗效果和安全性都无从谈起。

首先，细胞治疗用的是 “活细胞”，数量和活性直接影响疗效。比如给患者输注 CAR-T 细胞时，剂量多了可能引发副作用，少了又达不到治疗效果；干细胞治疗里，活细胞比例低，修复能力就会大打折扣。而细胞计数要做的，就是精准算出 “总细胞数” 和 “活细胞数”，帮医生确定最合适的治疗剂量。

其次，从细胞提取、培养到最终输给患者，整个过程都离不开计数监测。比如在实验室培养干细胞时，得通过计数判断细胞生长速度，决定什么时候该换培养液；冷冻保存的细胞解冻后，也要计数看看活性有没有下降，能不能继续用。

更关键的是，国际上对细胞治疗有严格标准。像国际标准化组织（ISO）专门出台了《ISO20391-1》《ISO20391-2》两个标准，美国 FDA 和中国药监局也有明确要求，只有通过规范计数、满足标准的细胞产品，才能用于临床。要是计数不准，就算细胞本身没问题，也可能通不过监管，无法给患者使用。

二、细胞计数有多难？这些 “拦路虎” 可不少

很多人觉得，细胞计数不就是 “数数” 吗？把细胞放在显微镜下数清楚就行。可实际操作中，科研人员要面对一堆难题，稍有不慎就会出错。

1. 细胞样本本身太复杂

细胞治疗用的样本里，不只有我们需要的治疗细胞，还可能混着死细胞、细胞碎片，甚至其他杂质。比如从患者血液中提取免疫细胞时，会同时存在红细胞、血小板，还有破碎的细胞残骸，这些都会干扰计数 —— 把碎片当成活细胞，结果就会虚高；漏数了小个头的细胞，结果又会偏低。

更麻烦的是，不同细胞的 “脾气” 还不一样。像间充质干细胞（MSC）个头大，大小还不均匀；诱导多能干细胞（iPSC）特别爱 “抱团”，形成密密麻麻的细胞团，根本没法直接数；T 细胞虽然个头均匀，但和其他免疫细胞长得像，很难区分。这些差异都让计数变得更复杂。

还有细胞的 “活性判断” 也是个难题。活细胞和死细胞不是非黑即白的，而是像 “渐变光谱” 一样，有中间状态。比如有些细胞膜没破，但已经失去了功能；有些细胞暂时休眠，看起来像死细胞，实际还能恢复活性。现在常用的染色法，比如台盼蓝染色，只能区分膜完整的细胞，很容易误判活性。

2. 计数方法太多，选对很难

目前常用的细胞计数方法有十几种，每种都有优缺点，选不对就会出问题。比如最传统的 “血球计数板法”，需要科研人员在显微镜下手动数细胞，成本低但特别费时间，还容易受主观影响 —— 不同人数出来的结果可能差 20% 以上。

自动化仪器虽然快，比如图像分析仪、流式细胞仪，但也有短板。图像分析仪容易被细胞团干扰，把一个细胞团当成一个细胞；流式细胞仪能精准分析细胞，但成本高，操作复杂，还需要专业人员维护。

就连染色剂的选择也有讲究。比如用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）双染色时，如果样本里有二甲基亚砜（DMSO，一种冷冻保护剂），会影响荧光强度，导致活细胞数被低估；用台盼蓝染色时，染色时间太长会杀死活细胞，结果同样不准。

3. 操作过程藏着 “隐形误差”

就算选对了方法，操作步骤中的小失误也会让计数结果跑偏。比如样本稀释时，没摇匀就取样，导致部分区域细胞密集，部分区域稀疏；染色时，染色剂浓度没调好，要么染不上色，要么染色过度；还有仪器校准不到位，比如显微镜焦距没调好，看不清小细胞，这些都会影响最终结果。

我认识一位做 CAR-T 治疗的科研人员，曾经因为样本解冻后没及时计数，等了 2 小时才操作，结果活细胞数比实际少了 15%—— 原来解冻后的细胞很脆弱，长时间放置会加速死亡，可当时没人意识到这个细节。

三、如何让细胞计数更精准？这些方法很实用

面对这么多难题，科研人员也总结出了不少解决方案，核心就是 “选对方法、做好验证、严控过程”。

1. 按 “用途” 选对计数方法

最重要的原则是 “适合的才是最好的”。比如在实验室培养细胞时，只是日常监测生长情况，用简单的图像分析仪就行；要是做产品上市前的质量检测，就必须用流式细胞仪，还要搭配台盼蓝染色法做 “双重验证”，确保结果可靠。

针对不同细胞类型，也要定制方案。比如计数爱抱团的 iPSC 时，要先用酶把细胞团打散，再用图像分析仪计数；计数间充质干细胞时，因为它个头大，要调整仪器的 “细胞大小识别范围”，避免漏数。

还有样本中的干扰物质，也要提前处理。比如样本里有细胞碎片，先用离心机离心，去除碎片后再计数；样本里有 DMSO 时，先稀释降低浓度，再用 AO/PI 染色，减少荧光干扰。

2. 给计数方法做 “全面验证”

就像药品上市前要做临床试验，计数方法也要经过严格验证，确保它准确、可靠。国际上常用的验证指标有 7 个，包括特异性（能不能区分目标细胞和杂质）、准确性（结果和真实值的差距）、精密度（多次测量结果的一致性）等。

比如验证 “自动化计数法” 时，科研人员会用已知浓度的标准细胞样本做测试，看仪器测出来的浓度和真实浓度差多少；还要做 “重复性测试”，同一个人多次操作，看结果波动是否在 5% 以内；不同人操作，看结果波动是否在 10% 以内，只有都达标了，方法才算合格。

3. 用 “过程控制” 减少误差

在操作过程中，还要设置 “多重把关”。比如每次计数前，用标准微球校准仪器，确保仪器状态正常；取样时，至少取 3 个样本做平行测试，结果取平均值；计数后，还要有人复查，比如用另一种方法再测一次，两次结果差不超过 10% 才算合格。

还有一些细节技巧，比如样本解冻后，要在 30 分钟内完成计数；稀释样本时，用移液枪精准控制体积，误差不超过 1%；染色时，严格计时，比如台盼蓝染色只能染 3 分钟，到点必须冲洗，避免损伤细胞。

四、上市细胞治疗产品的 “计数标准”：门槛不低

现在全球已经有几十种细胞治疗产品上市，比如治疗白血病的 CAR-T 产品 Kymriah®、治疗骨髓疾病的造血干细胞产品 Clevacord®，它们的计数标准都很严格，核心就是 “保证活细胞比例和剂量精准”。

首先是活细胞比例，几乎所有上市产品都要求活细胞占比≥70%。比如 Kymriah® 要求活细胞比例不低于 70%，造血干细胞产品 Clevacord® 要求活细胞比例不低于 85%—— 活细胞比例越低，治疗效果越差，风险越高。

其次是剂量控制，必须精准到 “每个患者的体重”。比如 Kymriah® 给体重≤50kg 的患者，输注剂量是 0.2-5.0×10⁶个活细胞；给体重＞50kg 的患者，剂量是 0.1-2.5×10⁸个活细胞，多一点少一点都不行。

要是计数结果不达标，比如活细胞比例只有 65%，能不能用呢？答案是 “要看情况”。如果能提供足够的证据，证明这些细胞虽然活性略低，但功能正常，不会引发安全问题，经过监管部门批准后也能使用。但这种情况很少见，大部分时候会被判定为 “不合格产品”，不能用于临床。

五、未来细胞计数会如何发展？这些技术值得期待

随着细胞治疗的发展，细胞计数技术也在升级，未来会更 “快、准、智能”。

比如现在已经有科研团队在开发 “实时监测系统”，把微型传感器放进细胞培养罐里，不用取样就能实时统计细胞数量和活性，避免了取样过程中的误差；还有人工智能（AI）辅助计数，通过训练 AI 识别不同细胞的形态、荧光特征，让计数速度提升 10 倍，误差降低到 5% 以内。

另外，“在体计数” 技术也在研发中 —— 过去只能在实验室计数，未来可能通过影像学技术，直接监测患者体内的细胞数量和活性，比如用近红外荧光成像，追踪干细胞在患者体内的存活情况，这能让治疗方案更精准。

不过，这些技术还需要时间完善，比如 AI 需要更多样本训练，在体计数需要解决 “穿透深度” 问题（比如如何看清体内深处的细胞）。但可以肯定的是，随着技术进步，细胞计数会越来越可靠，为细胞治疗保驾护航。

结语

细胞计数看似是 “简单的数数”，实则是细胞治疗的 “质量基石”。每一个精准的数字背后，都是科研人员对细节的把控，对患者安全的负责。未来，随着技术不断突破，我们相信细胞计数会越来越高效、精准，让更多细胞治疗产品安全地走进临床，帮助更多患者康复。