次要药效学研究内容、策略、方法、判定原则及对安全性的可能影响

对于药企来讲，开展次要药效学研究以确定小分子化药潜在的脱靶毒性，已经成为药物开发的标准流程之一。监管机构也越来越强调研究靶点与动物毒理发现之间的关系。众所周知，小分子的特异性并不好，超过一半的小分子药物至少结合5个不同靶点。真实数字可能更高，毕竟大部分药物只开展了有限的靶点结合验证，实际潜在靶点却超过数千个。多靶点结合带来的多药理作用并不完全是坏事，有可能使药物具有多个适应症，比如阿司匹林，结合23个不同靶点，调节多条信号通路，在抗炎、解热镇痛、心血管疾病中均发挥作用。也有药物因为脱靶结合而退市，比如抑制hERG或激活5-HT2b受体引发心脏安全性风险的药物。

由于靶点实在太多，不同CRO公司根据文献或者经验有不同的靶点谱，但究竟怎么开展体外次要药效学研究比较合理？比如筛选哪些靶点、采用什么技术、遵循什么策略等等，没有统一标准。来自Sanofi、Pfizer、GSK、Novartis等公司团队对这一问题进行了深入调研，并发表在《Nature Reviews Drug Discovery》。

次要药效学研究有一个基本的panel组合，是基于Bowes、Lynch等人早期研究建立的一个组合，包括44个靶点，这些靶点通常在脱靶研究中是要包括的，如下图所示。横坐标是次要药效学研究包含该靶点的公司的比例，参与调研的一共18家公司（14家收入超过100亿美金的大型药企，4家收入10-100亿美金的中等药企）。超过2/3公司开展了44个靶点中的35个，超过一半的公司开展了其中的40个靶点。

除了以上靶点外，根据对18家国际药企调研结果，还有额外33个新的靶点也建议添加到次要药理学研究的组合中。具体靶点清单、脱靶累及的组织或器官以及靶点激活或抑制潜在引发的毒性总结在下表之中。

除了靶点选择以外，次要药效学研究策略和方法也是值得关注的。比如是采用单一浓度点测试还是评估浓度-效应曲线，比如早期化合物比较多的情况下如何开展脱靶研究。关于这些问题，其实没有理想的策略。一种策略是将靶点分类，进行序贯研究，先选择其中的18个（如下表）脱靶率比较高且与临床关系明确的靶点进行测试，筛掉一些化合物后，再进行其他靶点的研究。检测模式分为3种，binding、Agonist、Antagonist，从下表中不难看出，binding测试往往会过高估计脱靶率。因此，脱靶研究鼓励进行功能性测试，而不是单纯看下结合与否。

完成以上靶点测试后，按照序贯研究思路，可对剩余化合物开展剩余59个靶点的研究，罗列如下。再回到之前的问题，开展单点研究还是浓度-效应曲线探索，通常的建议是先进行单点研究（比如10μM），对于潜在结合或有阻断、激活的脱靶靶点再针对性的开展浓度-效应曲线研究，获得潜在的EC50/IC50，并与临床拟用游离药物Cmax进行对比，评估可能的安全性风险。当然，77个靶点只是建议，有些药企次要药效学研究的靶点超过100个，理论上脱靶研究的越充分，后续开发风险也相对越低。

当然，并不代表脱靶就一定会产生不可接受的临床不良反应，也不能因为脱靶就将一个化合物判了死刑，需要基于具体靶点科学判断。通常采用的原则是“100倍”原则，即100-fold between affinity and maximal free exposure is commonly applied to be confident that a drug candidate will not reach levels high enough to have meaningful activity at the secondary target. 简言之根据检测模式不同，选择相应终点，如Ki，EC50、IC50、Kb，除以预估的人体游离Cmax浓度。但也要考虑一些靶点的特殊情况。比如Kv11.1(hERG)钾离子通道，至少30倍的安全窗口才认作低致心律失常风险。5-羟色胺5-HT2B受体，当抑制常数Ki与游离血浆药物浓度<10倍窗口，认为高风险，当10-70倍之间，认为中等风险，当>100倍，则认为是低风险。再比如，有些靶点在胃肠道高表达，药物口服给药，这样就不适合用血药浓度来评估风险。还有些靶点在颅内表达，药物不能透过血脑屏障，风险自然也就很低。除了根据靶点风险程度、靶点分布维度考量，还要考虑患者的疾病状态的影响。比如哮喘和慢性阻塞性肺病患者体内腺苷水平很高，如果药物脱靶抑制SLC29A1靶点，会使腺苷水平进一步增加，从而经低亲和力腺苷受体激活支气管肺C纤维，导致严重呼吸困难和支气管痉挛风险增加。还有些脱靶靶点潜在引发的临床不良反应可控，也可以根据获益-风险原则做下评估。当然，体外研究结果并不一样完全转化成体内风险，如果动物试验结果未发现潜在脱靶靶点介导的毒性，或者观察到次要药效的剂量和主要药效剂量之间窗口足够大，也不影响候选化合物的推进。

最后

在IND研究中，主要药效学研究在整个药理学研究内容中最受重视，直接决定了成药性中很核心的一环“有效性”，所以无论是体外药理、体内动物模型，基本都是围绕候选分子的有效性展开。次要药效学当然也会做，可能会有些固定的激酶谱、离子通道、受体谱开展一些研究，但更多的是作为“例行公事”的研究。其实，随着技术的进步以及对更多靶点生物学作用与临床效应之间的理解加深，次要药效学在解释产品可能的安全性风险方面发挥着越来越重要的作用。次要药效学研究的靶点也不再限于早期Bowes等人公布的44个靶点，而是扩大到77个甚至更多靶点的研究。越是早期能够将这些潜在的“雷”排查清楚，越是为后续扫除了很多障碍，降低了药物开发风险。还是那句话，脱靶不一定是坏事，有些可能会获得其他适应症的突破。脱靶也不一定将一个分子直接判死刑，而是需要根据靶点安全窗口、靶点分布、动物试验等综合评估，做药永远离不开的一点就是获益-风险分析。

引自：The state of the art in secondary pharmacology and its impact on the safety of new medicines一文

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