一作兼通讯！南京大学，最新Nature Chemistry！

化学键的形成与断裂是化学研究中的核心过程，其本质决定了分子的物理与化学性质。在单分子水平上实时观察化学键的动态变化，能够揭示传统群体测量难以捕捉的瞬态中间体。尽管单分子光学与 力谱技术已被用于研究溶液中的动态反应，但标记不完美常导致结果模糊，且难以实现无标记、多中间体的同步识别。生物纳米孔凭借其独特的几何结构，可被设计成纳米反应器，通过监测离子电流变化，实现对孔内壁反应位点上化学键形成与断裂的可视化，为理解复杂反应动力学与机制提供了新途径。

鉴于此，南京大学应佚伦教授综述系统总结了利用生物纳米孔作为单分子纳米反应器与生物传感器的最新进展。文章涵盖了纳米孔限制下的单分子反应动力学、生物纳米孔的设计策略，以及在单分子水平上揭示反应中间体与路径的研究成果。作者还指出了该领域尚未解决的问题，并对这一快速发展的方向提出了展望。相关内容以题为“Understanding single-molecule reactions using nanopore-based techniques”发表在最新一期《nature chemistry》上。

应佚伦，南京大学化学化工学院教授、化学与生物医药创新研究院双聘PI、国家优青(2020)，国家青年拔尖人才(2019)。主要从事光电纳米孔道单分子分析与超微电流放大核心模块研制，以第一或通讯作者在Nature Nanotechnology, Nature Chemistry等期刊上发表SCI论文90余篇，获2022年中国分析测试协会科学技术奖一等奖(1/10)、2016年联合国教科文组织世界最具潜力女科学家奖、2020年中国化学会青年化学奖、2020年度英国皇家化学会Analyst新锐科学家讲座奖等及2023年美国化学会“Rising Star in Measurement Science”；现为Elsevier期刊Results in Chemistry编辑、《电化学》青年编委、ACS Sensors编委、ACS Measurement Science Au编委、ChemElectroChem编委和Analyst顾问编委等；是英国皇家化学会分析科学委员会委员、日本东北大学客座教授等

【单分子反应的动力学模型】

纳米孔内的单分子反应可通过离子电流的变化实时反映，其动力学常被建模为伪一级反应过程（公式1）：

反应持续时间 tonton 可用于计算键断裂速率常数 koff=1/ton ，而反应事件频率 f=1/toff与反应物浓度 [R]成正比，据此可求得键形成速率常数 kon=f/[R]。进一步地，结合 Ka=kon/koff ，可获得平衡结合常数。纳米孔反应器中的动力学受到空间限制、驱动力（如电泳力EPF与电渗流EOF）以及局部化学环境的显著影响。一项四态动力学模型提出，有效碰撞分数（ECF）是决定反应效率的关键因素（公式3）：

该模型强调了在纳米孔限制下，反应物取向、能量壁垒与局部环境对反应路径的调控作用。

图 1. 用于研究单分子反应的生物纳米孔

【设计用于单分子反应的纳米孔限制】

构建高效的纳米孔反应器需从三个方面入手：反应位点的精准引入、反应物的高效捕获，以及有效碰撞的促进。（1）反应位点的引入：早期研究通过定点突变在孔道狭窄区域引入半胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）等具有活性侧链的天然氨基酸（图1a）。例如，在AeL纳米孔的238位点引入Cys（K238C AeL），可用于监测二硫键交换与硫醇取代反应。此外，还可通过化学修饰（如Met113与氧杂氮丙啶试剂反应）或引入非天然氨基酸（如炔基、硒代半胱氨酸）以拓展反应多样性（图2a–c）。遗传密码扩展技术进一步实现了在AeL、MspA等纳米孔中高效、可控地引入功能性非天然氨基酸。（2）增强反应物捕获效率。通过调控孔道内壁电荷分布，可增强EOF或EPF，从而提升中性或低电荷分子的捕获效率。例如，在AeL中引入带正电的赖氨酸（如N226Q/S228K AeL）可显著增强EOF，实现对多种电荷状态分子的高效捕获（图2d）。此外，通过定向进化获得大孔径ClyA-AS纳米孔（直径约5 nm），可直接容纳单个酶分子（如DHFR），并监测其催化过程中的构象变化（图2e）。（3）增强有效碰撞：延长反应物在孔内的停留时间是提高反应效率的有效策略。例如，将AeL中带正电的Lys238替换为中性Cys或甘氨酸，可破坏原有的离子对，形成静电壁垒，显著延长带电分子的停留时间（图2f）。K238C AeL中带正电的谷胱甘肽（GSH）停留时间延长约7倍，从而大幅提升二硫键形成效率（图2g）。

图 2. 设计用于单分子反应的纳米孔限制

【利用纳米孔揭示单分子反应】

识别短寿命中间体：纳米孔技术具备微秒至毫秒级的时间分辨率，可用于捕捉反应过程中的瞬态中间体。例如，在α-HL纳米孔中监测Cys与有机砷化合物的反应，识别出DTT水解过程中的两种中间体；通过电流阻塞步骤还可实时追踪聚合物链的生长与降解动力学。此外，通过共价引入光敏基团，纳米孔还能捕获传统方法难以检测的亚稳态中间体，如光诱导的硝酸酯中间体。揭示反应路径：通过分析电流子水平之间的转换概率，可重构单分子反应路径。例如，在含His的α-HL纳米孔中，金催化炔酸转化为烯醇内酯的过程被分解为五态转换，完整描绘了催化循环路径（图3a）。在Cys突变的α-HL反应器中，与4-磺基苯胂酸的反应产生七个不同的电流水平，分别对应七个反应组分，通过计算相互转化速率，揭示了复杂的Walden循环网络（图3b）。此外，通过控制氧气环境，纳米孔还可模拟酶促反应中的氧化还原循环，揭示质子驱动、氧诱导的二硫键断裂路径。

图 3. 利用设计的纳米孔记录单分子共价反应

【调控反应选择性与平衡】

定向位点选择性：通过在纳米孔内沿横向或纵向依次引入Cys等活性残基，可实现多位点的空间控制反应（图3c–d）。例如，在α-HL中构建Cys轨道，可引导带有二硫键的底物在电场作用下发生硫醇-二硫键交换，实现位点与区域选择性。通过“传感中合成”策略，还可在K238C AeL中逐步引入反应物，制备具有特定空间构型的异质纳米孔（如1,3,5-3R-AeL），用于识别具有手性氨基酸的肽异构体。调控反应平衡：纳米孔内的反应速率与平衡常因空间限制、局部pH、静电作用及外电场等因素而不同于体相反应。例如，在K238C AeL中，硫醇与碘乙酰胺的反应速率比体相提高约1400倍。通过调节电压可稳定或 destabilize 反应中间体，如在CuAAC反应中，低电压有利于延长铜π络合物中间体的寿命（图4b）。此外，反应位点周围的局部环境（如G234C AeL中的中性环境）也会显著影响反应速率（图4c）。

图 4. 利用外部电场和邻近的氨基酸调整和控制纳米孔内的反应平衡

【总结与展望】

图 5. 用于单分子合成的纳米孔设计概念

纳米孔技术为在单分子水平上监测与调控化学反应提供了强大平台。通过精准设计纳米孔的结构与化学环境，研究者已能够识别短寿命中间体、揭示反应路径、调控反应选择性与平衡，从而深入理解单分子化学机制。然而，当前对纳米孔限制效应的理解仍需深化，尤其是在动态结构变化与中间体寿命匹配方面。未来，通过结合冷冻电镜、质谱、光谱学与人工智能算法，纳米孔技术有望在时间分辨率与结构解析方面实现突破。此外，将纳米孔与人工材料（如碳纳米管、MOF、COF）结合，或构建基于GUV的大规模反应阵列，将进一步拓展其在单分子合成与生物传感中的应用前景，为化学、生物与能源领域带来新的机遇。

来源：高分子科学前沿

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