浙江
做免疫荧光的你，是否也经历过这样的至暗时刻：满心期待地跑到显微镜前，看到的却是一片模糊 —— 目标信号微弱得几乎看不见，背景还布满了令人抓狂的非特异性染色。这样的结果图和自己的梦中情图相差甚远！
左图图例：抗 - METTL14 兔抗（货号: HPA038002）；中 / 右图：丁香园社区
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那如何能拿到一张美美的荧光实验图呢？
默克为您准备了免疫荧光小贴士及免疫荧光图谱分析技巧！
让您轻松搞定荧光实验并快速分析结果
1
了解您的目标蛋白
您的目标蛋白是膜蛋白，细胞质蛋白还是细胞核蛋白？
◈UniProt 数据库，描述了该蛋白的亚细胞定位
◈Human Protein Atlas 数据库，可看到该蛋白的免疫荧光染色图片，直观的显示亚细胞定位情况
2
实验优化
如果实验结果不理想，可以进行以下优化：
01. 没有信号，或者信号弱
◈目标蛋白是胞内蛋白：需要通透
抗体不能直接进入细胞膜，需要在膜上打孔，抗体才进入并识别抗原。当细胞使用甲醛固定时，需要通透步骤：使用 0.5% Triton X-100（in PBS）或皂苷室温孵育 2～10 min 即可。时间过长或浓度过高都可能导致细胞裂解。
◈目标蛋白表达丰度低：需要信号放大
当目标蛋白的表达丰度比较低时，需进行信号放大 — 使用生物素（biotin）标记的二抗，搭配链酶亲和素偶联的荧光素（如 Streptavidin−FITC，货号 S3762）
◈固定方法不当，破坏了抗原表位：更换固定剂
常使用的固定剂有多聚甲醛（交联固定）和预冷的甲醇（凝聚固定），多聚甲醛固定有可能产生蛋白交联，屏蔽抗原表位。
而预冷的甲醇固定有可能改变抗原位置。因此当使用某一种固定剂结果不理想，可以更换另一种固定剂。
◈ 荧光粹灭：加二抗后避光操作，封片后及时拍照
02. 高背景
◈优化封闭步骤
可以适当延长封闭时间，或者使用二抗宿主来源的血清进行封闭。
例如：如果二抗是山羊抗兔荧光二抗，可以使用 5% 的山羊血清室温封闭 1 h。
◈ 二抗不特异也会带来高背景
建议增加对照组，只加二抗不加一抗，如果对照组也有高背景，建议更换二抗。
◈ 增加一抗的稀释比例
说明书中的稀释比例不一定适用于您的样本。建议设置一抗稀释梯度，选择最适合的一抗稀释比例。
03. 对照实验的设置
◈内源性组织背景对照：
某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应确保自发荧光不会干扰实验结果。
◈ 阳性对照：
如有已证明可表达目标抗原的细胞，无论是内源性还是通过修饰「敲入」或过表达基因，细胞都可用作阳性对照，用于确认当靶标存在于样本中时，染色实验方案能产生信号
◈ 阴性对照：
已知不表达目标抗原的某种细胞可用作阴性对照样本。另外，如有经基因改造无法表达目标蛋白的细胞（敲除细胞）也可作为靶标特异性的有力对照。
3
免疫荧光图谱分析
这里结合文献中的一张典型图片来详细讲解下：
◈靶点在转录水平表达
在做蛋白检测的同时，一般会检测 mRNA 水平的表达情况，在蛋白和 RNA 层面做相互印证。
◈目标蛋白的荧光图谱
对大脑皮层，内侧隔核及背外侧被盖核乙酰胆碱能神经元标志物 ChAT 与 GFP，DAPI 进行染色，分析不同标记荧光蛋白交叉情况，判断不同蛋白是否在统一空间表达。
但是，如果一抗不特异，再怎么优化也无济于事。
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内容策划：沈佳钰
内容审核：钟可可
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