疫苗佐剂究竟是如何发挥作用的？

疫苗是公共卫生领域最有效的干预措施之一，在减轻传染病导致的发病和死亡方面发挥重要作用。这点在新冠大流行中相信很多人都印象深刻。疫苗必须具备两个功能：1）提供作为免疫反应靶点的抗原；2）提供能够引导免疫系统对靶抗原产生适当反应的免疫刺激信号。对于很多疫苗来说，免疫刺激信号来自一种额外添加的成分，称为佐剂。佐剂在蛋白质和多糖抗原基础的亚单位疫苗的开发中发挥了特别关键的作用，因为这些疫苗单独使用时通常免疫原性很差。

疫苗佐剂对免疫反应影响是多方面的，可以促进B细胞亲和力成熟，改变体液反应的广度，增强抗体产生或记忆T细胞和B细胞反应的持久性，并控制记忆T细胞和B细胞反应的规模和表型。佐剂还可能对先天免疫产生长期影响。

关于佐剂增强疫苗的免疫反应这点已经得到充分验证，但佐剂通过何种机制实现的影响往往知之甚少。

佐剂在成分组成上多种多样，作用机制也不相同。最早临床使用的佐剂是基于铝悬浮液和油包水乳剂，之后出现了一些新型佐剂如Toll样受体（TLRs）。新冠期间，通过脂质纳米颗粒（LNPs）递送的mRNA疫苗大放异彩。本文就佐剂的分类、作用机制等进行总结。

佐剂分类

简单将佐剂类型分为下图中的几类，并逐一介绍。

第一类佐剂是作为抗原储存库以实现抗原的持续释放。这些佐剂通常是生物材料，它们可以包裹或吸附添加的抗原，然后在注射后缓慢释放抗原。最古老的疫苗佐剂是明矾（这是一个化学上的误称，用来指代铝盐、磷酸铝或氢氧化铝佐剂）。最初人们认为明矾主要作为抗原储存库发挥作用，但有几项研究表明，这并非适用于所有抗原。此外，明矾还可以通过在注射部位引起局部细胞死亡来诱导炎症，从而促进抗原的摄取和运输到引流淋巴结。其他抗原储存库佐剂还包括阳离子脂质体（例如CAF01）、可生物降解的聚合物颗粒和可注射水凝胶。

第二类佐剂是在明矾之后广泛应用于临床的佐剂，基于油包水或水包油的乳剂，包括临床配方如MF59和AS03。这些佐剂通常对抗原递送没有储存库效应，也没有作用于特定的免疫学途径，但它们能够被注射部位的细胞摄取，从而激活炎症体和细胞死亡途径。这种局部炎症反应有助于促进抗原的摄取和运输到引流淋巴结，从而增强免疫反应。然而，炎症体激活和细胞死亡途径并非乳剂佐剂发挥作用的必要条件，或者可能只影响免疫反应的某些方面，说明这些佐剂的潜在机制是复杂的。

皂甙构成了第三类佐剂。皂甙是从智利皂树（Quillaja saponaria）中首次分离出来的天然产物，属于糖脂类萜烯。这些化合物具有类似表面活性剂的特性，能够与细胞膜相互作用。尽管目前尚未发现它们作用的特定受体，但已证实它们可以诱导细胞产生应激反应和炎症体激活，从而促进免疫反应。然而，与乳剂佐剂类似，到目前为止发现的皂甙的作用机制只能部分解释它们的佐剂活性。尽管单独的皂甙由于毒性过大而不适合广泛用于人类疫苗，但将皂甙与胆固醇复合可以降低其毒性，同时保持其作为疫苗佐剂的效力。几种皂甙配方已经经过了广泛的临床测试，佐剂AS01b（脂质体皂甙和单磷酸脂质A）和Matrix M（皂甙/磷脂纳米颗粒）已被用于几种已获上市许可的疫苗中。

近年来，人们投入了大量精力开发针对特定生物受体的先天免疫刺激化合物作为佐剂，特别是那些识别与病原体入侵或组织损伤相关的分子模式的“危险信号”传感器。例如，包括TLR激动剂、凝集素受体激动剂以及激活细胞内危险信号传感器（如视黄酸诱导基因I（RIG-I）或干扰素基因刺激因子（STING））的化合物。

许多“危险信号”和皂甙佐剂是小分子化合物，其药代动力学特性不利于作为疫苗的安全有效使用。因此，将这些化合物成功应用于疫苗的一个重要方法是将它们配制成脂质体或油包水纳米乳剂（例如，AS01b中将TLR4激动剂单磷酸脂质A纳入脂质体），或者吸附到明矾上（例如，AS37中将苯并萘啶类TLR7激动剂吸附到明矾上）。这种组合佐剂可能具有协同促进免疫的作用。

佐剂作用机制

疫苗佐剂的作用通常始于注射部位，如下图所示。

调节免疫细胞募集和延长注射部位抗原作用时间

大多数疫苗出于方便、安全和耐受性考虑选择肌肉注射给药。大多数佐剂会刺激局部先天免疫细胞或基质细胞释放炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6和I型干扰素）和趋化因子（如CCL2、CCL4、CCL5和CXCL8）。传统佐剂如铝佐剂和油包水乳剂通过诱导局部细胞死亡和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放来实现这种局部刺激，而更具针对性的分子佐剂（如Toll样受体激动剂）则通过其在组织中表达或被募集到疫苗注射部位的先天免疫受体发挥作用。这些趋化因子和局部炎症会迅速在24小时内将中性粒细胞、单核细胞和髓系树突状细胞（DCs）募集到注射部位，并促进抗原递呈细胞（APCs）的激活。重要的是，肌肉和/或引流淋巴结中的局部炎症可以在不引起人类不适的情况下实现这些效果。因此，避免全身分布是佐剂设计的既定策略。

除了局部炎症/免疫细胞募集方面的作用，佐剂还可以减缓抗原在注射部位的清除，为抗原在淋巴中的运输以及注射部位和引流淋巴结中细胞的摄取提供更长的时间窗口。这种效应对抗原初次免疫反应尤其重要。其实，最初将铝佐剂作为佐剂开发的主要原因就是一些抗原可以强烈吸附在铝佐剂上，从而在免疫后实现更大的持久性。

延长疫苗可用性对下游免疫反应有多种影响。在免疫后，生发中心（GCs）在几天内启动，活化的B细胞开始增殖周期和体细胞超突变，以亲和力成熟其抗原受体。如果在免疫后7到14天，当生发中心反应中首次产生亲和力成熟的抗体时，抗原仍在到达引流淋巴结，那么到达的抗原可以被捕获在滤泡树突状细胞上的免疫复合物中，这些细胞是滤泡中的特殊基质细胞，可以在数周甚至更长时间内在其表面展示抗原。这些细胞因此可以作为抗原库，以驱动生发中心反应。在小鼠中，延长疫苗可用性已被证明可以增强生发中心和T滤泡辅助细胞（TFH）反应，增加抗体滴度，并增加体液反应的广度。在非人灵长类动物（NHPs）中，初次免疫期间延长抗原作用时间证明可以增加生发中心反应的克隆性，募集极其罕见的B细胞前体参与免疫反应，并启动可以持续至少6个月的生发中心。因此，开发能够实现这些动力学效应的人疫苗佐剂/递送系统颇为重要。

调节抗原在淋巴器官的转运和蓄积

佐剂的一个关键作用机制是促进抗原运输到淋巴器官，从而增加抗原在引流淋巴结（dLN）中的可获得性。这种可获得性的增强可以影响后续的免疫反应，包括抗原特异性淋巴细胞的扩增、淋巴细胞的分化以及B细胞在GCs中的亲和力成熟。如上所述，佐剂（如明矾、油包水乳剂和Toll样受体激动剂）通过诱导细胞因子和趋化因子来刺激注射部位的免疫细胞募集和抗原摄取，随后通过细胞介导的方式将抗原运输到引流淋巴结。这种细胞介导的抗原运输在注射后数小时内开始，并在约24到48小时达到峰值，且可能会持续超过一周。

佐剂还可以直接调节募集到注射部位的APCs迁移到引流淋巴结的效率。例如，被脂多糖和某些氧化磷脂刺激的DCs会进入一种“高活性”状态，伴随着与细胞迁移和趋化相关的基因表达增加、运动能力增强以及从外周组织向淋巴结的迁移增加。

除了促进细胞介导的抗原运输外，佐剂还可以直接影响淋巴中的抗原运输，即非细胞依赖的抗原运输。纳米颗粒能够有效地通过淋巴从组织中运输，因此纳米颗粒佐剂可以用于促进抗原在淋巴中的摄取和运输。例如，基于聚合物或表面活性剂稳定的氢氧化铝纳米晶体的铝佐剂可以在淋巴中运输，而不是停留在注射部位，从而将吸附的抗原携带到引流淋巴结。

对于黏膜免疫的场景，抗原和佐剂被应用于鼻黏膜等上皮屏障时，如突变型霍乱毒素和壳聚糖等佐剂可以直接促进抗原跨黏膜屏障的摄取，从而允许抗原通过淋巴引流到达次级淋巴器官，它们通过短暂破坏上皮细胞间连接和/或改变细胞旁路运输来实现这一过程。

抗原进入淋巴的量增加，并不能保证适应性免疫反应的增强，除非这些抗原能够在下游的dLN中被捕获。佐剂可以通过调节抗原从淋巴窦进入淋巴结实质，或者通过促进抗原被淋巴结驻留细胞捕获，来促进这一过程。淋巴结的窦腔由淋巴内皮细胞和巨噬细胞衬里，窦巨噬细胞被认为在捕获和转移抗原（以病毒颗粒或免疫复合物的形式）进入淋巴结中发挥重要作用。油包水佐剂已被证明可以促进抗原在窦巨噬细胞和滤泡DCs的细胞内隔室中留存，作为抗原储存库，以维持免疫反应。然而，包括油包水乳剂、Toll样受体激动剂和皂甙在内的多种类别的佐剂，也被证明会迅速引发窦衬巨噬细胞的消失（可能是死亡），这与淋巴结中抗原累积增加有关。窦衬巨噬细胞层的破坏并非合成疫苗佐剂的独特特征，在活病毒和细菌感染期间也会发生。

佐剂还可以影响进入引流淋巴结的抗原的捕获。免疫复合物和被补体修饰的抗原被具有补体受体的B细胞捕获，并转移给滤泡树突状细胞，从而在B细胞滤泡中实现抗原的长期保留。因此，能够持续释放抗原1到2周的缓释生物材料佐剂，可能通过在新形成的免疫复合物中捕获抗原，促进抗原传递给滤泡树突状细胞。

另外，考虑到增强抗原运输、增加抗原进入淋巴结和在引流淋巴结中捕获的加强，三种机制之间是互补的，作用于这些不同途径的联合佐剂可能会具有协同作用。

先天免疫激活和免疫细胞募集到淋巴结

如上所述，佐剂在注射部位发挥重要作用，但它们对dLN的下游效应同样至关重要。注射后，各种佐剂迅速（在数小时内）在引流淋巴结中诱导高水平的细胞因子和趋化因子。细胞内细胞因子染色和转录组学研究表明，这些炎症反应很大程度上可以是淋巴结自身产生的因子，尽管细胞因子/趋化因子也可以通过淋巴管从注射部位快速运输到淋巴结。

这种淋巴结局部的炎症在某些情况下可能反映了佐剂对淋巴结内细胞的直接影响，因为颗粒状和分子佐剂已被证明可以在注射后几分钟到数小时内通过淋巴运输到达引流淋巴结。对于基于危险信号的分子佐剂，这可能反映了佐剂直接刺激髓系细胞或淋巴细胞。或者，佐剂可以激活细胞死亡和应激反应途径。例如，油包水佐剂已被证明可以诱导淋巴结髓系细胞的内质网应激和上调未折叠蛋白反应（UPR）途径，从而在引流淋巴结中产生炎症细胞因子和趋化因子。明矾和油包水乳剂佐剂也可以激活炎症体的组分，从而引发类似的淋巴结炎症，尽管不同佐剂所需的炎症体复合体的关键组分可能不同。值得注意的是，UPR相关基因的早期激活已被证明是人流感疫苗中保护性抗体滴度的生物标志物。如上所述，许多佐剂会迅速诱导窦衬巨噬细胞的死亡，细胞死亡机制（如焦亡）可能在进一步塑造淋巴结内的先天免疫激活中发挥重要作用。这些途径会导致特定细胞因子（如IL-18和IL-1β）的释放，这些细胞因子在响应常见的危险信号刺激（如单独的Toll样受体激动剂）时通常不会被释放到细胞外。

这些因子的上调通常会伴随着明显的淋巴结肿大（淋巴结质量可增加五倍）以及在24小时内从血液和/或淋巴中募集先天免疫细胞和淋巴细胞到引流淋巴结。这大大增加了淋巴结中可用的淋巴细胞总数，这种扩张可以持续长达2周。快速的免疫细胞募集与佐剂在引流淋巴结中对抗原积累的影响相结合，增加了罕见的T细胞和B细胞前体与同源抗原相遇的可能性。与此同时，淋巴结局部的炎症还激活了APCs，以促进有效的T细胞和B细胞激活。APCs（包括传统树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和B细胞）被佐剂激活，上调MHC和共刺激受体，从而促进抗原呈递。与整体淋巴结炎症类似，APCs的激活可以通过危险感受器佐剂对其受体的直接作用，或者通过激活这些细胞中的应激反应途径来诱导。此外，如油包水乳剂所示，因佐剂诱导的炎症而被募集到引流淋巴结的单核细胞可以被诱导分化为单核细胞来源的树突状细胞，从而在随后的免疫反应中参与抗原呈递。有趣的是，与初次免疫反应相比，加强免疫后先天免疫细胞中诱导的基因表达模式可能不同，这表明初次免疫对后续剂量佐剂的作用具有反馈效应。总之，促进引流淋巴结中的先天免疫激活是佐剂的关键机制之一。

改变抗原呈递和淋巴细胞效应分化

除了促进抗原在dLN中的累积外，一些佐剂还直接影响APCs在单细胞水平上对抗原的摄取、处理和/或递呈。将细胞外抗原通过I类MHC分子呈递是一种疫苗可以用来促进CD8阳性T细胞反应的机制。此外，佐剂还可以影响CD4阳性T细胞的激活。在人类中，将油包水佐剂与裂解型流感疫苗联合使用被证明可以诱导循环单核细胞和树突状细胞中抗原处理和呈递基因的表达。佐剂在树突状细胞中诱导的细胞因子环境和激活状态直接影响CD4阳性T细胞的分化。

训练免疫（trained immunity）

尽管疫苗的设计目的是诱导持久的抗原特异性适应性免疫，但越来越多的证据表明，某些疫苗（如卡介苗（BCG）、Shingrix和口服脊髓灰质炎疫苗）可以以抗原非特异性的方式提供对不相关感染的异源保护。这些流行病学观察结果得到了临床前研究的补充，这些研究表明BCG疫苗接种可以提供针对广泛病毒（如流感病毒和SARS-CoV-2）的保护。在BCG疫苗接种的情况下，人们推测疫苗对不相关病原体的有益效果至少部分是通过诱导先天免疫记忆（或训练免疫）实现的。训练免疫是指髓系细胞及其前体的长期转录、表观遗传和代谢重编程，从而在再次遇到微生物时导致先天免疫反应的增强或减弱。佐剂能够特异性靶向先天免疫系统的模式识别受体（PRRs），促使人们认为佐剂可以通过诱导训练免疫来增强疫苗的免疫原性和效力。

在疫苗接种的背景下，几种PRR激动剂也可以触发髓系细胞的长期重编程。TLR7/8激动剂3M-052已被证明在小鼠髓系细胞中诱导长期的转录组和表观基因组特征。单核细胞显示出ISG、干扰素调节因子（IRF）和信号转导及转录激活因子（STAT）基因位点的基因表达增加和可及性增加，这些变化在免疫后持续长达28天。油包水纳米乳剂佐剂MF59同样在初次免疫后诱导了先天免疫的持久转录特征。此外，MF59疫苗接种诱导了先天免疫的转录特征水平增加，尤其是在加强免疫后髓系细胞的激活增强，表明诱导了训练免疫。

这些发现表明，佐剂可以被用来持久地重编程先天免疫系统，以在疫苗接种后触发增强的免疫反应。

mRNA疫苗中的佐剂活性

核酸疫苗研发已有30多年历史，指的是将重组 DNA 或 RNA 抗原递送至宿主细胞。mRNA 疫苗在新冠疫情期间凭借脂质纳米颗粒（LNP）递送技术，首次大规模证明了这种亚单位疫苗方法的安全性和有效性。这些mRNA 疫苗的成功，部分得益于用合成替代物替换 mRNA 中的某些天然碱基，可显著降低细胞对重组 mRNA 的先天免疫识别，提高其稳定性，增加翻译效率并延长其存续。例如，辉瑞-BioNTech 和 Moderna 的新冠 mRNA 疫苗均采用了核苷修饰，将尿苷替换为 N1-甲基假尿苷，这种修饰能够增强 mRNA 的翻译效率，同时避免过度激活先天免疫反应。

mRNA 疫苗研发速度快、成本较传统蛋白疫苗低，且具有平台性质，即相同的生产工艺可应用于每种新疫苗产品，这些优势使其在应对未来大流行/流行病病原体暴发时具有重要意义。

目前，基于修饰碱基 mRNA 的新冠疫苗和呼吸道合胞病毒疫苗以及基于α病毒衍生的自复制 RNA 的新冠疫苗已获临床批准，还有更多疫苗候选产品处于临床试验的后期阶段。所有获批的 RNA 疫苗均基于 LNP 递送的 mRNA。这些 LNP 制剂通常由 pH 敏感的可电离脂质、辅助脂质和胆固醇组成，其研发重点是保护 RNA 免受核酸酶的提前降解，促进细胞摄取和内质网逃逸，从而在宿主细胞的细胞质中翻译编码的抗原。然而，LNP 也具有重要的佐剂活性。在临床前模型中，将空 LNP 与蛋白抗原混合时，空 LNP 是一种强效佐剂，可促进依赖于可电离脂质成分的TFH和生发中心 B 细胞的发育。空的LNP 在给药后几小时内可在dLNs中诱导高水平的 IL-6。携带修饰碱基 mRNA 的 LNP 和由非修饰碱基 mRNA 形成的脂质复合物（RNA-LPX）均能强烈激活人、小鼠和非人灵长类动物细胞产生 IL-1β。IL-1β是把双刃剑，既助于小鼠在 mRNA 疫苗接种后 CD8 +T 细胞的启动和早期记忆发育，同时也是 mRNA 疫苗高剂量出现毒性的关键因素之一。

另外，已上市mRNA疫苗中使用的LNP还有进一步优化和调整空间。通过筛选脂质制剂库已发现一些 LNP 在体外和体内显示出增强的转染能力和 DC 激活能力，与获批的新冠 LNP 制剂相比，可增强癌症疫苗的 T 细胞启动。

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