《食品科学》：大理大学何作顺教授等：余甘子冻干粉拮抗镉亚急性暴露致小鼠肝损伤的作用及机制

镉及其化合物因良好的物理性质被广泛应用于工业生产，但它是一种环境和职业污染物，会在肝脏、肾脏、肺脏和睾丸等多种器官中蓄积，进而对这些器官造成损伤。其中，肝脏是镉及其化合物蓄积的主要靶器官之一。

余甘子（

Phyllanthus emblica

L.），也称滇橄榄，富含多酚、黄酮类、氨基酸、维生素等大量有益于人体的活性成分 ，具有抗氧化、抗炎、抗菌等多种健康效应 。既往研究显示，余甘子能够拮抗铅、 对乙酰氨基酚、四氯化碳、环磷酰胺等物质引起的肝损伤，其主要活性 成分是多糖、多酚、黄酮类化合物，可通过抗氧化、抗炎和抗凋亡发挥保肝作用 。余甘子冻干粉（PEFP）能否拮抗镉亚急性暴露所致的肝损伤，其拮抗的机制如何，目前鲜见相关报道。

大理大学公共卫生学院的赵波、谷仕燕、何作顺*等探讨PEFP拮抗镉亚急性暴露致小鼠肝损伤的作用，并采用RNA测序结合蛋白免疫印迹实验对涉及的机制进行初步探讨，以期拓宽PEFP的具体用途，并为镉毒性防治研究提供思路和科学依据，具有良好的创新性及重要的科学研究价值。

1 PEEP对体质量增长率和肝脏系数的影响

小鼠体质量增长率和肝脏系数见表1，与Control组相比，CdCl2 组体质量增长率（（13.97±2.06）%）下降（

P

＜0.05），肝脏系数（（5.59±0.29）%）升高（

P

＜0.05），提示镉可能造成小鼠肝损伤。PEFP干预后肝脏系数为（5.20±0.24）%，相比 CdCl2 组下降（

P

＜0.05），提示PEFP可能有拮抗镉致肝毒性损伤的作用。

2PEFP对肝脏镉含量的影响

由图1可知，PEFP组（（0.24±0.02）μg/kg）和Control组（（0.15±0.01）μg/kg）镉含量无统计学差异（

P

＞0.05）。 CdCl2 组（（3.49±0.09）μg/kg）和PEFP+ CdCl2 组（（2.94±0.13）μg/kg）肝脏中的镉含量显著高于Control组（

P

＜0.05），而PEFP+ CdCl2 组镉含量显著低于 CdCl2 组（

P

＜0.05）。

3 PEFE对CdCl2致肝功能的影响

如图2所示，与Control组相比，PEFP对ALT、AST和ALP均无影响，CdCl2处理组的小鼠AST、ALT、ALP（（707.55±60.19）、（614.58±24.40）、（186.85±12.51）U/L）水平显著升高（

P

＜0.05）。与单独CdCl 2 组相比，经过PEFP干预的 CdCl2 处理小鼠AST、ALT、ALP（（461.33±48.77）、（301.80±15.80）、（125.19±16.00）U/L）水平降低（

P

＜0.05）。

4 PEFE对CdCl2致肝脏氧化损伤的影响

与Control组相比，CdCl2显著降低了酶促抗氧化剂SOD、Gpx（（32.63±1.23）、（8.64±0.47）U/mg）的水平（

P

＜0.05），而与 CdCl2 组相比，PEFP联合处理提高了酶促抗氧化剂SOD和Gpx（（53.74±5.19）、（12.18±1.30）U/mg）的活性（

P

＜0.05）。单独给予PEFP处理的小鼠与Control组相比，SOD和Gpx的活性无明显变化（

P

＞0.05），见图3。

5 HE染色

由图4可知，Control组和PEFP组肝脏结构正常，肝索排列有序，肝细胞正常。与Control组相比，CdCl2处理组出现肝血窦扩张、充血，肝细胞嗜酸性变、肿胀、多灶溶解性坏死伴炎细胞浸润。与CdCl2处理组相比，PEFP+CdCl2组上述组织病理学病变明显减轻。

6 PEFP处理对CdCl2致肝细胞凋亡的影响

如图5所示，Control组（凋亡率（2.24±0.37）%）和PEFP组（凋亡率（2.71±0.14）%）可见少量的绿色荧光（凋亡细胞）且荧光强度较弱。与Control组相比，CdCl2 组绿色荧光点最多，凋亡率最高，为（32.89±2.53）%。与单独 CdCl2 处理的小鼠相比，经过PEFP干预的 CdCl2 处理小鼠凋亡率降低至（16.37±2.08）%（

P

＜0.05）。

7 肝脏的RNA转录组学分析

RNA测序结果显示，Control组与CdCl2组之间有1 234 个共同差异基因（819 个上调、415 个下调），见图6A。PEFP+CdCl2组与CdCl2组之间有151 个共同差异基因（35 个上调、116 个下调），见图6B。聚类分析结果显示Control组、CdCl2组和PEFP+CdCl2组间基因存在显著差异，见图6C。Venn图结果显示，Control组和CdCl2组与CdCl2组和PEFP+CdCl2组之间共有69 个共同差异基因（图7），提示这69 个差异基因可能是PEFP预防镉致小鼠肝损伤的潜在基因。对筛选出的69 个存在表达差异的基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径的富集分析，发现其主要富集于白介素-17信号通路、冠状病毒疾病-COVІD-19、Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、钙信号通路等炎症相关的信号通路（图8）。基因本体（GO）分析结果显示，差异基因主要富集在白细胞迁移、中性粒细胞迁移等的生物过程；细胞组分分析显示差异基因主要存在于细胞质核糖体、膜筏等区域；从分子功能来看，差异基因主要集中于核糖体的结构组成成分、白介素-1受体结合活性、细胞因子受体结合、细胞外基质结合、金属内肽酶抑制剂活性等（图9）。基于差异表达基因编码的蛋白，由蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPІ）（图10）结果可知，差异表达基因编码的蛋白AnnexinA2（Anxa2）、Mcp1（Ccl2）、Galectin3（Lgals3）、S100A11等与多种分子间存在直接相互作用关系，并选择AnnexinA2（Anxa2）、Mcp1（ccl2）、Galectin3（Lgals3）、S100A11进行蛋白免疫印迹验证，结果如图11所示，Control组和PEFP组AnnexinA2、Mcp1、Galectin3、S100A11的蛋白表达水平没有统计学差异（

P

＞0.05），CdCl2组AnnexinA2、Mcp1、Galectin3、S100A11的蛋白表达量分别为Control组的1.53、1.32、4.28、1.91 倍，差异均具有统计学意义（

P

＜0.05）；PEFP+CdCl2处理组中AnnexinA2、Mcp1、Galectin3、S100A11较CdCl2组蛋白表达水平下调，但又高于Control组（

P

＜0.05）。AnnexinA2、Mcp1、Galectin3、S100A11的蛋白水平与RNA测序结果趋势一致。

体质量变化和脏器系数常作为反映动物健康状况及毒性损伤的重要指标，本研究结果显示，CdCl2暴露显著降低了小鼠体质量、升高了肝脏系数（表1），这与Zheng Jiaming、Fang Zhijia等研究报道的一致，联合PEFP干预处理后肝脏系数显著下降，提示PEFP对镉暴露致肝损伤有一定的逆转作用，其中，PEFP的剂量是根据2020年版《中国药典》推荐成人每天服用的剂量9 g/d进行转换计算，并选择使用了高剂量。此外，本研究发现PEFP干预后肝脏组织中镉的水平下降（图1），提示PEFP可能减少肝脏对镉的吸收。镉积累会引起肝损伤，诱导氧化应激。抗氧化酶SOD、Gpx常被用作测量氧化损伤状态的重要参数。研究结果显示，镉处理增加了血清AST、ALT和ALP的活性（图2），降低了肝脏中SOD和Gpx的活性（图3）。这些结果为镉可引起肝损伤和氧化应激、导致肝功能障碍提供了佐证，这与Wu Haifeng和李变丽等的报道一致。重要的是，PEFP干预显著降低了小鼠血清中AST、ALT和ALP的水平，提高了肝脏SOD和Gpx的活性，提示PEFP对镉致肝损伤有保护作用。同样，本研究中CdCl2处理后肝脏出现肝血窦扩张充血，肝细胞嗜酸性变和多灶溶解性坏死伴炎细胞浸润，这一结果提示镉造成肝组织炎性损伤，可能是由于镉进入体内后影响肝细胞内的游离Ca2+浓度，导致肝细胞受损或死亡，进而引发一系列炎症反应。此外，镉诱导肝细胞氧化应激，导致细胞凋亡，并通过线粒体途径加重肝细胞损伤，这些过程也会促进炎细胞浸润。本研究结果表明，PEFP干预后，肝细胞病变减轻（图4），表明余甘子中的活性成分可能通过抗氧化而抑制炎症介质的释放， 进而对镉损伤的小鼠肝脏起保护作用。TUNEL染色结果显示CdCl2引起的肝细胞凋亡率在PEFP干预处理后显著降低（图5），文献报道镉暴露会诱导过度线粒体分裂和抑制线粒体自噬而引起细胞凋亡，余甘子可通过清除自由基等抗氧化机制改善线粒体功能而发挥抗凋亡作用，而在镉暴露致肝癌中余甘子提取物通过诱导细胞周期停滞在G2/M期和诱导细胞凋亡有效抑制细胞的增殖]。这些结果提示PEFP可以逆转镉诱导的肝细胞炎性浸润和凋亡。

RNA测序结果显示，差异基因共同富集路径主要聚集在炎症相关的信号通路，并且PEFP干预处理逆转了大多数CdCl2改变的基因，如AnnexinA2、Mcp1、Galectin3、S100A11等，推测PEFP处理可能是通过炎症等途径拮抗镉致肝损伤。AnnexinA2属于钙依赖性磷脂结合蛋白，参与细胞氧化还原反应，此外，AnnexinA2的失调和异常表达还会造成炎性肝损伤。本研究中，AnnexinA2在CdCl2组中上调，并且在PEFP干预后下调（图11），表明了PEFP可以逆转CdCl2诱导的肝损伤，其机制可能包括减少氧化应激和炎症减缓损伤。钙结合蛋白A11（S100A11）可诱导细胞凋亡、参与炎症反应，S100A11通过与晚期糖基化终末产物受体相互作用激活核因子-κB，诱导促炎性细胞因子的产生，导致中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞迁移。本实验中CdCl2致S100A11表达上调，通过PEFP干预后S100A11表达下调（图11），表明了PEFP拮抗镉致肝损伤可能的机制是减少S100A11的表达减少炎症反应和抑制凋亡。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），亦称为CC趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2 ，CCL2），其高表达会导致白细胞浸润引起炎症发生，镉诱导CCL2表达。与上述报道一致，本研究发现镉组中MCP-1表达明显高于Control组，并且在PEFP干预后明显下降（图11），表明该基因可能作为镉致肝损伤的潜在靶点。研究表明，Galectin3在肝脏受到毒性损害的过程中被激活，其表达水平在炎症、非酒精性脂肪肝、肝硬化乃至肝癌等肝脏病理状态下显著升高。在目前的研究中，与RNA测序研究相一致，蛋白免疫印迹结果显示CdCl2组中Galectin3表达上调，PEFP降低了CdCl2诱导的小鼠肝细胞中Galectin3的水平（图11），因此，PEFP可能通过调节Galectin3的表达抑制炎症反应，从而保护肝脏免受损伤。转录组学结果分析了PEFP干预处理下CdCl2诱导肝脏的差异基因，蛋白免疫印迹验证结果与RNA-seq的结果一致，支持了RNA测序数据的有效性。

结论

PEFP可以改善镉亚急性暴露致小鼠的肝损伤，可能的分子机制是PEFP通过减少氧化应激、炎症反应、凋亡和调节AnnexinA2、Mcp1、Galectin3、S100A11等蛋白表达水平拮抗镉致肝损伤。本项研究为PEFP预防镉致肝损伤提供了新证据，同时为合理利用和扩宽开发余甘子提供理论基础。

本文《余甘子冻干粉拮抗镉亚急性暴露致小鼠肝损伤的作用及机制》来源于《食品科学》2025年46卷第06期164-171页，作者：赵 波，谷仕艳，梅宗钦，李汶泓，马顺蓉，申开颜，何作顺*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240827-198。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：北京化工大学王小云；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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