疫苗生产的 “加速器”：生物反应器技术的现状与展望

摘要：生物反应器技术在基于细胞培养的病毒疫苗生产中应用广泛，尤其在新冠疫情期间，其发展与应用为高效、低成本的疫苗生产提供了可能，以满足全球疫苗需求。本文从病毒疫苗的类型、用于疫苗生产的动物细胞系入手，介绍了生物反应器的主要类型，总结了与病毒大规模扩增相关的重要参数及其对病毒产量的影响，系统评估了利用生物反应器生产不同病毒（SARS-CoV-2、流感病毒、热带病毒、肠道病毒和狂犬病病毒）的工艺优化方法，还探讨了生物反应器与计算生物学的协同发展，旨在为实验室模拟疫苗生产和工业大规模疫苗生产提供有价值的信息。

一、引言

在基于细胞培养的大规模病毒疫苗生产中，生物反应器扮演着至关重要的角色（图 1）。随着疫苗生产工艺的进步，越来越多可扩展的生物反应器和对病毒具有高亲和力的细胞系被应用于不同疫苗的生产。1962 年，Capstick 等人驯化 BHK21 细胞实现悬浮培养，并将其应用于兽用疫苗生产；1967 年，VanWezel 开发了微载体，实现了贴壁细胞在生物反应器中的培养，这标志着大规模细胞培养的开始。20 世纪 80 年代后，CHO 细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动了生物反应器在生物制药行业的应用，到 20 世纪末，其规模已达到 10,000 升。目前，随着流加培养、灌注培养和基因工程等技术的发展，生物反应器已成为利用细胞生产多种病毒载体、活病毒和病毒基疫苗的平台，这些生物反应器结合了传统系统的低剪切环境和自动化系统的可扩展性，具有更广阔的应用前景。

新兴传染病严重影响社会稳定，对人类健康构成重大威胁。特别是由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）已在全球蔓延。面对疫情，疫苗研发速度前所未有地加快，截至 2022 年 4 月 4 日，全球已接种 112.5 亿剂疫苗。公共卫生专家估计，只有极高水平的 SARS-CoV-2 疫苗接种才能诱导群体免疫。然而，病毒肆虐使许多低收入国家经济受重创，疫苗生产和采购资金有限，导致全球疫苗分配不均。此外，mRNA 疫苗生产中存在基础原料缺乏和生产规模扩大困难等瓶颈；而传统全病毒灭活技术生产的疫苗虽更易分发和储存（仅需冷藏），但产量无法满足群体免疫需求。

对于大多数类似于新型冠状病毒的病原体，大规模疫苗生产对全球疾病控制和根除至关重要，因为病毒的高突变率可能导致疫苗保护力下降。因此，对病毒疫苗生产和培养的研究，尤其是实验室规模的探索迫在眉睫。利用生物反应器培养细胞生产抗原、抗体等产品是生物制品大规模生产的核心技术。生物技术中的精细过程控制与高表达细胞系的筛选驯化相结合，可提高生产效率和产品质量，降低成本。基于实验室规模的实验，我们可以优化一些常规的物理和化学参数，提前在更大规模上获得更完善的培养方案，节省后续工业化时间。更重要的是，实验室规模的实验可以为新生物制品，特别是新疫苗的研发提供中试条件，以最大限度地提高产量和质量。

图1病毒疫苗的上游培养工艺概述

二、基于生物反应器的疫苗生产（一）疫苗类型

在众多疫苗中，针对病毒病原体的主流疫苗大致可分为两类：灭活疫苗和减毒活疫苗。在这一公认的分类中，可应用不同的技术方法，产生几种亚型疫苗，如蛋白亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、复制型病毒载体疫苗和核酸疫苗（图 1C）。以下介绍这些疫苗的不同技术方法：

蛋白亚单位疫苗：基于合成肽或重组蛋白，利用病毒蛋白或蛋白片段引发免疫反应。

病毒样颗粒疫苗：包含模拟病毒结构的病毒蛋白，但不含遗传物质。

病毒载体疫苗：使用非复制型病毒将含有病毒基因的 DNA 传递到人体细胞中。

灭活疫苗：在连续细胞系或组织中培养病毒，然后对病毒进行纯化、浓缩和灭活。

减毒活疫苗：消除特定病毒成分或使用密码子优化来降低毒性，同时保留免疫原性。

当病毒传播和突变时，可能会出现现有疫苗无法保护的新毒株，这会导致不同类型疫苗的保护效果发生变化。具有高突变率的病毒不适合减毒活疫苗，因为它们的突变在疫苗生产过程中可能会逆转。此外，减毒株在细胞培养中的复制可能会减少，导致工艺产量下降。相比之下，用野生型病毒制备的灭活疫苗可产生更多病毒，但高致病性野生型活病毒可能需要 3 级生物安全条件。高表达细胞系的筛选和驯化作为细胞培养大规模疫苗生产的重要组成部分，将在下一节介绍。

（二）细胞系的选择与发展

病毒传播的细胞培养系统的发展促进了病毒疫苗的发展。原代培养的鸡胚成纤维细胞常用于人用疫苗的生产。目前，连续细胞系克服了原代细胞系的缺点，能够适应现代细胞培养技术，主要利用 “设计细胞系” 来提高病毒产量。这些设计的细胞经过精心定义，特别是作为一种细胞基质用于特定目的。

Vero 细胞系只有在有合适的微载体表面时才能增殖。Baxter 公司生产的 Preflucel® 是一种基于 Vero 细胞的季节性灭活流感疫苗，于 2010 年获得欧盟许可，该疫苗由 H1N1、H3N2 和 B 型流感病毒三株组成，Vero 细胞在 Cytodex3 微载体上生长。最近一项以水疱性口炎病毒（VSV）为模型的研究发现，在无血清培养基（SFM）中悬浮的 Vero 细胞的最大细胞密度与商业 SFM 中观察到的相似或更好，即在 IHMO3 培养基中可获得更高的细胞密度（8×106 细胞 /mL）。

Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞已成为流感疫苗生产中的主要悬浮细胞系。目前，MDCK 悬浮细胞在带有交替切向流（ATF）灌注系统的生物反应器中扩增，甲型流感病毒的最高病毒滴度保持在 4.37 log10（血凝单位（HAU）/100μL），感染性病毒滴度为 1.83×1010 病毒颗粒 /mL。

PER.C6 细胞也能在 SFM 中短时间悬浮至高密度（高达 107 细胞 /mL），无需任何固体支持，并且对所有流感病毒株都敏感，因此 PER.C6 细胞系也被用于流感疫苗生产。

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系是一种受欢迎的新型 “设计细胞系”，CHO 细胞培养技术的改进也是当前研究的主流方向。例如，Schmitz J 等人证明，MSCC 在比生长速率、细胞直径和 eGFP 产量方面有利于哺乳动物细胞的小规模培养，这在疫苗生产的细胞培养阶段具有重要意义。此外，在表达 hIgG1 的 CHOBC 克隆中，使用 ActiCHO 工艺与传统工艺相比，细胞体积和单克隆抗体滴度显著增加。CHO 细胞系具有复杂的糖基化系统，有助于 SARS-CoV-2 的稳定表达，可增加具有更高抗体检测敏感性和特异性的糖基化刺突（S）蛋白的含量。最近，中国科学院微生物研究所与安徽智飞龙科马生物制药有限公司联合开发的新冠重组蛋白疫苗就是 CHO 细胞生产的疫苗。Esposito 等人表明，在 32°C 下使用固定化金属离子亲和色谱（IMAC）柱捕获并通过脱盐柱纯化时，疫苗研究中心（VRC）S 蛋白的产量高于 5 mg/L。

人胚肾细胞系 HEK293是重组蛋白瞬时表达的主要细胞系。HEK293 细胞通过转染切割的人腺病毒 5（Ad5）而永生化，腺病毒蛋白 E1A 和 E1B 的基因整合到其基因组中。这两种蛋白的表达可通过调节细胞周期和凋亡来促进 HEK293 细胞的生长。Expi293FTM 也用于生产新型冠状病毒疫苗，目前，使用常规转染试剂和方案，受体结合域（RBD）的最终产量为 90 mg/L。

每种病毒都有其最适合生长的细胞系，如医学研究委员会细胞株 - 5（MRC5）等人二倍体细胞，由于其遗传稳定性和对人体使用的不良反应较少，是最合适的细胞系。尽管人二倍体细胞培养适合疫苗生产，但不适合大规模培养，细胞密度无法突破瓶颈。

三、用于病毒生产的生物反应器的发展与工艺优化（一）生物反应器的类型

传统上，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞等都在含有血清和饲养层的条件下进行扩增和传代，构成标准的二维（2D）培养模型。这种方法需要分离饲养层，但存在病原体污染的风险，且操作不便。培养的干细胞容易发生变异，细胞产量也有限。生物反应器的使用在一定程度上解决了这些问题。早期生物反应器的设计理念主要基于微生物发酵的搅拌式生物反应器。随着相关技术的不断成熟，人们设计了许多低剪切力的生物反应器，以克服搅拌式生物反应器产生的剪切力对动物细胞的影响。

细胞培养技术的大规模工业化和商业化的关键在于设计合适的生物反应器。细胞培养反应器也是整个疫苗生产过程中的关键设备，它为细胞提供合适的生长环境，决定培养细胞的质量和产量，并影响疫苗的生产效率和产品质量。病毒疫苗生产还可以使用连续多级培养系统或固化剂。作为两级生物反应器，连续生物反应器可以在稳态条件下运行（固定的细胞和代谢物浓度、pH 值，避免停机清洗和灭菌）。细胞培养生物反应器可分为机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器和一次性生物反应器。根据细胞的培养方式，这些生物反应器可分为三类：贴壁培养生物反应器、嵌入式培养生物反应器和悬浮培养生物反应器。我们列出了这些生物反应器的优缺点以及与生物反应器相关的生物安全风险（表 1）。

近年来，各种规模的静态细胞系设备都得到了更新和改进。目前，一次性固定床生物反应器，如 iCELLis®500 和 500 + 系统，已用于贴壁细胞培养技术，以生产高产量的活病毒。一次性床生物反应器操作简单灵活，节省时间，并且可以使用介电常数传感器在线监测 pH、溶解氧（DO）和温度等培养参数。在基于 Vero 细胞的重组水疱性口炎病毒活疫苗生产中，一些研究使用了最新的 Univercells 的 scale-X 固定床生物反应器系统，每表面积的病毒滴度增加了 2-4 倍。固定床生物反应器领域的最新发明是康宁的 Ascent 生物反应器，它采用不同的低剪切策略为细胞提供氧气和营养。酶消化可以分离 2D 培养中的细胞，使其非常适合高产量和可扩展的病毒载体合成。对于体外基因治疗的应用，由于 iCELLis 系列中缺乏可能更适合体外治疗的中型生物反应器，Univercells 推出了具有竞争力的固定床生物反应器 scale-X 生物系列。研究表明，慢病毒和腺病毒载体在 iCELLisNano 和 scale-XHydro 生物反应器中具有相同的生产力，但 scale-XHydro 中的细胞分布优于 iCELLisNano。在贴壁细胞培养模式中，细胞只能贴附在旋转瓶壁上，如果需要扩大细胞生长规模，会受到人力、成本和厂房空间的限制，因此难以实现工艺放大。这些限制促进了悬浮培养的研究进展。对于工艺优化，悬浮培养的选择可以被认为比贴壁工艺更好。例如，Cytiva 新开发的 Wave 25 生物反应器具有先进的传感器、智能控制策略等功能，增强了摇摆技术，在维持细胞活性和提高病毒产量方面表现出可靠和准确的性能。 Sartorius 开发的 Ambr250 生物反应器最多可运行 48 个平行生物反应器，培养体积为 100-250 ml，它具有小规模多模块系统，这是贴壁生物反应器的一个缺陷。悬浮培养的优势在于可以利用更先进的自动化技术实现大规模生产。在未来的大规模生产中，悬浮培养必将取代传统的贴壁培养，成为主流方法。

表 1 细胞培养生物反应器类型及生物安全风险

（二）通过工艺优化提高病毒产量

上游生物工艺开发的目的是降低整体制造成本。原则上，作为底物的细胞系越多，产生的病毒量就越大。此外，保持细胞系处于最佳状态是产生大量病毒的另一个关键因素。在整个上游过程中，保持细胞系处于病毒生产的最佳条件非常重要，以便能够产生尽可能多的细胞材料。这可以通过在整个制造过程中调整几个参数来实现。生物反应器中不同参数的工艺定义如图2A所示。工艺参数包括物理和化学参数（温度、pH、DO、渗透压、剪切力和营养供应）、病毒感染复数（MOI）、感染时间（TOI）、有机营养物和无机离子。在以下部分中，我们将介绍上述参数和当前主流的细胞培养方法。

细胞浓度和代谢/生理状态
在细胞增殖阶段，动物细胞培养产生的大多数生物制品都是不断复制和合成的。例如，重组蛋白通常以分批或分批方式生产，当培养基中的浓度达到峰值时可以收获一次。相比之下，病毒疫苗的生产通常需要细胞生长阶段。通过病毒复制阶段（分批模式），大多数病毒在复杂的过程中通过多次感染不断复制，这包括宿主细胞、病毒 RNA/DNA 和病毒蛋白的合成，以及子代病毒的释放。病毒的复制和释放通常会导致细胞裂解，因此可以在病毒材料浓度达到峰值时分批收获。一般来说，细胞浓度决定最终的病毒滴度。细胞培养的关键营养物质和累积的副产物会抑制病毒扩增，如乳酸和氨。细胞状态对细胞环境中病毒生产的影响如图2B所示。在小规模培养中可以模拟合理的参数，以提供最佳的细胞环境。然而，在大规模培养中优化参数将付出更高的代价。

图2 生物反应器中的工艺定义及其对细胞环境的影响结果

剪切应力
平行层相互滑动的过程称为剪切。搅拌和鼓泡产生的剪切力可能会影响生物反应器中包膜病毒的生成。例如，Grein 等人发现麻疹病毒在生物反应器中容易受到剪切应力的影响，他们发现在某些情况下，搅拌和鼓泡使病毒滴度降低了1000倍。此外，顶部空间曝气可以为细胞培养提供足够的氧气，减少喷雾引起的剪切效应。目前，有新的生物反应器可以在很大程度上克服剪切应力的影响。 Sartorius Stedim Biotech 的一次性生物反应器 BIOSTAT®RMTX 配备了用于温和搅拌的一次性 Flexsafe®RMTX 工艺袋，设计有专门的端口用于非手动重力收获。这种独特的重力收获概念避免了手动操作造成的污染风险，减少了剪切应力对脆弱细胞的影响，并最大限度地提高了细胞回收率。尽管贴壁培养中的剪切力低得多，但难以放大。悬浮培养则恰恰相反。因此，应进一步探索减少悬浮培养中剪切应力的方法，以提高大规模培养中的病毒产量。

感染复数
病毒主要通过培养基传播到靶细胞，因此在计算病毒的最佳接种数量时，应考虑病毒在到达靶细胞之前的降解 / 灭活。二次感染是连续培养中的关键因素。在这个过程中，病毒的运输和传播以及再吸附感染遵循复杂的数学模型。在搅拌罐生物反应器级联扩增培养病毒的情况下，通常存在一个最佳的 MOI 值，即可以收获的最高病毒滴度。此外，对于大多数病毒，如果感染时每单位细胞的病毒颗粒数量过高，可能会导致所谓的缺陷干扰颗粒的复制，降低可实现的最大病毒产量。

停留时间和收获时间点
当细胞或病毒保留在封闭系统中时，它以分批培养模式运行。通常，当达到最大滴度时，病毒的感染滴度和病毒颗粒总数将开始下降。然而，细胞外 DNA 和蛋白质的污染水平开始显著增加的时刻是收获病毒的最合适时间。

与经典的重组蛋白生产过程不同，在病毒疫苗生产过程中，细胞生长和病毒复制阶段使用的参数条件不同。因此，必须对不同阶段采用特定的工艺策略。在稳态条件下，要实现病毒疫苗生产的较高生产能力和较低成本，需要确定最佳的病毒保留时间和收获时间。这可以防止病毒的快速降解和相关的产量下降，并且感染性病毒颗粒的比例将相对较高，这有利于减毒活疫苗或病毒载体的生产，如重组痘苗疫苗和甲型流感病毒疫苗。然而，目前尚不清楚是否可以在病毒疫苗生产中进行过程控制和监测。美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局提出的关于细胞和病毒株长期遗传稳定性的几个开放性问题仍有待回答，特别是在连续培养过程中过度生产是否会导致病毒突变，以及时间对产品效率和安全性的负面影响。

微载体培养
微载体培养被认为是最有前途的动物细胞大规模培养技术，它兼具悬浮培养和贴壁培养的优点。在培养容器的培养基中加入无害的微载体颗粒，使细胞能够附着在微载体表面生长，并通过持续搅拌使微载体保持悬浮状态。

由于最大可用生长面积的差异，贴壁细胞的细胞密度存在差异。生物反应器中经常添加微载体以增加贴壁细胞的细胞密度。Rourou 等人表明，在 3 g/L 的微载体 Cytodex 1 上生长的 Vero 细胞可获得2.6×106 细胞/mL 的细胞密度水平。然而，微载体的缺点之一是需要接种大量细胞，这可能会加剧细胞密度效应，使生产规模难以扩大。为了生产和维持许多依赖贴壁的细胞，通常使用基于微载体的搅拌罐生物反应器；然而，这可能会因生物反应器中有害的流体动力学剪切应力而导致细胞病变效应（CPE）。作为一种新的解决方案，已提出中空微载体（HMCs）来保护细胞免受搅拌生物反应器中的剪切应力影响。同时，它还能确保充足的气体和营养供应以及均匀的传质速率。这有利于在工业规模上大规模扩增对剪切敏感的锚定依赖细胞。

高细胞密度病毒培养
随着疫苗需求的增加，基于细胞培养的病毒疫苗生产过程也需要一系列技术增强，以克服传统疫苗生产的缺点。对于许多用于疫苗生产的常规细胞系，生产细胞的数量在 2×106 细胞/mL 到 4×106 细胞/mL 之间，这是一种高细胞密度。已经开发了一些用于高细胞密度过程的工艺和方法，许多生物反应器产品（声学过滤器、基于中空纤维的系统和 CellTank® 等）已进入市场。研究发现，通过改进的培养策略，如流加培养和灌注策略，可以获得高细胞密度。然而，高细胞密度培养会降低细胞特异性病毒产量，并出现细胞密度效应（即当细胞在高细胞密度下感染时，病毒 - 细胞表达系统中的比生产力下降）。细胞密度效应是一种普遍现象。研究表明，灌注技术可以限制细胞密度效应，通过提供连续的营养丰富的环境可以避免不必要的副产物积累，从而保持细胞特异性产量。

灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，因此可以在短时间内低温回收保存，有利于保持产品的活性。然而，灌注培养操作复杂，细胞培养基的利用效率低。因此，可能需要在培养中及时更换培养基。一项研究表明，在获得最佳比例并调整某些营养物质的浓度和渗透压后，所获得的培养基只需一半的灌注速率即可维持 3×107 细胞 /mL 的密度。这为灌注培养基的开发提供了参考。高密度和高活力是灌注培养的主要特点；然而，不可能无限增加细胞密度。过高的细胞密度会使培养基粘度过高，无法进行后续培养。为了将细胞密度控制在稳定水平，需要调整灌注速率。最近的研究表明，通过检测细胞特异性灌注速率和底物代谢，可以实现灌注速率的自动化和高精度控制，以达到更高的细胞浓度，病毒浓度可达 1×1010病毒 /mL。然而，灌注培养操作复杂，细胞培养基的利用效率低。对于灌注培养技术，培养基更换过程可能导致无菌风险增加，并且系统无法以最佳的培养基交换速率运行。

四、不同类型病毒的大规模培养

工艺优化包括细胞系、理化参数、微载体培养技术和高细胞密度培养技术的优化。当同一病毒在不同的细胞系、培养基和生物反应器中生长时，病毒产量会有所不同，在保持其他条件不变的情况下，仅改变温度、pH、MOI 等理化条件也会对病毒产量产生显著影响。因此，找到适合不同病毒生长的最佳条件，将有助于大幅提高病毒产量，从而增加疫苗产量，满足全球疫苗需求。在本节中，我们将总结和评论用于大规模生产 SARS-CoV-2、流感病毒、热带病毒、肠道病毒和狂犬病病毒的具体工艺优化方法（表 2）。

表2 细胞培养中病毒生产过程概述

（一）SARS-CoV-2

2020 年，新冠肺炎疫情在全球爆发，对公共安全构成巨大威胁。世界卫生组织（WHO）已宣布其为突发公共卫生事件。鉴于新冠肺炎疫情的严重性，开发针对 SARS-CoV-2 感染的安全有效的疫苗已成为研究热点。截至 2022 年 2 月 20 日，有 195 种疫苗候选物处于临床前开发阶段，144 种疫苗候选物处于临床开发阶段。它们主要使用四种疫苗平台：灭活病毒、蛋白亚单位、腺病毒载体和 mRNA。面对日益紧张的疫情形势，迫切需要使用更高效的生物工艺生产更多疫苗，以满足全球疫苗需求。

已有一些研究描述了 SARS-CoV-2 在生物反应器中的大规模扩增。例如，Offersgaard 的团队在 0.5 L CelCradle TM500-AP 小瓶中接种 1.5×107Vero 细胞，该小瓶带有 5.5 g BioNOC TM II 载体，在无动物培养基中培养 7 天后，细胞总数达到（2.2-2.5）×109细胞/小瓶。当 MOI 为 0.006，病毒温度为 33°C 时，感染 72 小时后 SARS-CoV-2 的感染峰值滴度为 7.3 log10 50% 组织培养感染剂量（TCID50）/mL，六次收获的滴度≥6.5 log10 TCID50/mL，总共产生 10.5 log10 TCID50（约 5 L）。

BBIBP-CorV 疫苗是世界上第一个 SARS-CoV-2 灭活疫苗。与 CelCradle TM500-AP 相比，已开发出基于篮式反应器中新型载体的 BBIBP-CorV 库存生产策略，以确保高效生产。MOI 范围为 0.01 至 0.3，感染 48-72 小时后，获得 7.0 log10 50% 细胞培养感染剂量（CCID50）/mL。在固体流化床培养系统中，培养的细胞处于相对静止的状态，这使得困难的高密度细胞培养变得简单易行。除此之外，根据 Wang 等人的研究，在三种候选病毒株中，HB02 株在 Vero 细胞中产生的病毒产量最高，并且在 10 代内没有氨基酸变异，这意味着不同类型的病毒株将极大地影响最终产量。

ChAdOx1n CoV-19（AZD1222，Vaxzevria）是一种有效的基于腺病毒载体的抗 SARS-CoV-2 疫苗。用于制造疫苗的病毒可以由 HEK293 细胞产生。Joe 等人在 BalanCDHEK293 培养基和 Pall Allegro 生物反应器中培养 HEK293 细胞，最终细胞生长至约（2.5-3.0）×106细胞 /mL。当 MOI 范围为 5 至 10 时，在感染后 42-48 小时（hpi），腺病毒载体达到 5×1011病毒颗粒（VP）/mL。该团队成功实现了迄今为止最大规模的病毒载体制造活动，以低成本提供了全球新冠肺炎疫苗供应的很大一部分。这种生产效率大约是先前公开的腺病毒分批生产或补料分批生产的两倍。因此，灌注培养不仅适用于普通哺乳动物细胞系，也适用于腺病毒载体的生产。

基于 rVSV 载体的 SARS-CoV-2 疫苗研究也在进行中。Kiesslich 等人分别比较了在 MDXK 培养基和 IHM03 培养基中生产 rVSVInd-msp-sf-Gtc 的情况。他们在 MDXK 培养基中培养 Vero 细胞，并提供 31°C、pH 7.2、溶解氧（DO）50% 的培养环境，以达到 1.02×106 细胞 /mL 的最佳细胞密度。在 48hpi 时，MOI 为 0.01，感染滴度为 3.59×109 TCID50/mL，基因组滴度为 2.13×1010 病毒基因组（VG）/mL。

目前，使用重组蛋白技术开发的新冠肺炎疫苗已上市（如 ZF2001 和 NVX-CoV2373）。这种疫苗的重点是抗原基因，而不是整个病毒。它也需要 CHO 细胞，其中许多已被基因工程改造用于瞬时表达，如 Epi CHO、CHO Freestyle Max 和 CHO-S。Johari 等人将 CHO-S 细胞置于为 CHO 细胞生长优化的化学限定培养基（CDCHO）中进行悬浮培养，该培养基含有 8 mM L - 谷氨酰胺，温度保持在 37°C。当 CHO-S 细胞密度达到 1.5×106细胞 /mL 时，用聚乙烯亚胺（PEI）处理。然后，将带有 100 个相对启动子单位（RPU）启动子的载体和刺突基因转染到电穿孔的细胞中，并将温度降至 32°C 进行流加培养生产，最终收获 53 mg/L 的纯化刺突蛋白。类似地，Pino 等人将密码子优化的 CHO Express™细胞悬浮在 EX-CELL®Advanced™CHO 培养基中，并保持 37°C 的温度，然后用含有 SARS-CoV-2 Spike DNA 序列的载体 pXLG6（ExcellGene SA）重新转染。10 天后，将其转移到 50 ml Tube Spin® 生物反应器（TPP，Trasadingen，瑞士）中的培养基进料生产中，并冷却至 31°C。然后将这种培养物以 5×105细胞/mL 接种到 10 和 40 L 搅拌罐生物反应器中，导致产量显著增加（数据未列出）。因此，CHO 表达系统不仅产量高，而且可用于大规模生物反应器。

Vero 细胞因其高敏感性而广泛用于 SARS-COV-2 的生产，表达病毒蛋白的 CHO 细胞也是当前研究的重点。与其他病毒的生产相比，有更多全新的生物反应器用于 SARS-COV-2 的生产。然而，仍有必要加强整个培养过程的环境监测，并优化培养基。

（二）流感病毒

与 SARS-CoV-2 类似，甲型流感病毒也对世界健康构成重大威胁。对于流感疾病的治疗，疫苗是最有效和安全的方法。基于细胞培养的工艺也已建立。不同的宿主细胞系，如 MDCK、Vero、AGE1.CR 或 PER.C6 细胞可用于生产流感病毒。例如，Lai 等人使用新的哺乳动物细胞系 PBG.PK2.1 和中空纤维 ATF 系统（ATF2）进行高密度培养，最终细胞浓度高达 50×106细胞 /mL，最大 HA 滴度为 3.93 log10（HA 单位/100 ml）。PBG.PK2.1 细胞可以达到高细胞浓度，化学限定培养基可用于细胞培养，并且可以简单地放大，因此是非常有前景的疫苗生产候选细胞系。此外，他们还使用反应器进行两次灌注培养，细胞的感染浓度达到约 4.6×106/ml，最大滴度达到（3.93±0.05）log10（HA 单位/100 ml）。这证实了使用灌注装置可以实现更好的生产，并能够连续收集病毒。因此，越来越多的研究倾向于利用灌注技术。Bissinger 等人在半灌注模式下悬浮培养 MDCK 细胞，当 MOI 为 10-1 时，病毒滴度可达 4.5 log10（HAU/100 ml），TCID50 可达 1010 病毒颗粒 /mL。在同一组的另一项类似研究中，半灌注培养被扩展到带有 ATF 灌注系统的生物反应器中。该团队通过调整 pH 和温度，实现了 4.37 log10（HAU/100μL）的累积 HA 滴度（HAaac）值（4.7×1011病毒 /mL）。

如上所述，ATF 灌注系统对病毒生产有一定影响。Coronel 等人将 SB10-X 轨道摇动生物反应器（OSB）用于切向流过滤（TFF）和 ATF。在 OSB 的最佳灌注条件下，CSVY 可达 3500 个病毒颗粒 / 细胞，体积病毒生产力（Pv）为 2.2×1012 个病毒颗粒/L/d，最高 HA 滴度为 3.73 log10（HA 单位/100 ml），最高 TCID50 滴度为 8.8×109个感染性病毒颗粒 /mL。但与 ATF 系统相比，他们发现倾斜沉淀器（inclined settler，IS）可以获得更多病毒，总共产生（5.4-6.5）×1013个病毒颗粒。当 IS 1 中的胰蛋白酶活性最高（1.5×106U/细胞或38 U/mL）时，细胞群在 24 hpi 完全感染。当感染浓度为 25×106细胞/mL 时，细胞特异性病毒产量高达 3474 个病毒颗粒 / 细胞，显著提高了 IAV 的产量。这将流感病毒的生产推向了一个新的高度。因此，通过引入新的灌注生物反应器或调整培养中的理化参数，可以改进用于甲型流感病毒生产的灌注技术。灌注培养易于放大，且每年对流感病毒疫苗的需求很大，因此使用灌注培养技术扩大流感病毒疫苗的生产是一个不错的选择。

（三）热带病毒

登革热是一种由蚊子传播的病毒感染，有四种血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）。目前，只有 Dengvaxia® 疫苗获得许可。无血清培养基已用于细胞培养多年。Liu CC 等人的研究表明，在无血清培养基中，Vero 细胞或 MRC-5 细胞中观察到的四种 DEN 血清型的病毒产量总是比在血清培养基中高 0.3 至 2.6 倍，并且 Vero 细胞中的峰值病毒滴度比 MRC-5 细胞高 1-17 倍。但 Lee HC 的团队在后续研究中证实，从 MRC-5 细胞克隆的 DEN-4 病毒更稳定。尽管在微载体上生长的 MRC-5 细胞的基因稳定性比 Vero 强，但其扩大培养仍然是一个难题。

寨卡病毒（ZIKV）属于黄病毒科黄病毒属，主要通过蚊子叮咬传播。细胞系和生物反应器的选择对寨卡病毒的生产也有巨大影响。Nikolay 等人从在杜尔贝科改良 eagle 培养基（DMEM）中生长的 BHK-21 悬浮细胞生产寨卡病毒，并使用 3 L 一次性 Mobius® 生物反应器，将 pH 维持在 7.1。为了提高滴度，该团队使用 ATF 系统进行灌注培养，当 MOI 为 0.001 时，感染 4 天后病毒产量达到 3.9×107PFU/ml。尽管悬浮细胞的比病毒产量与贴壁细胞培养相比仍然较低，但已经建立了足够大的 ZIKV 生产工艺。随着灌注技术的进步，该团队还在配备 ATF/TFF 系统的生物反应器中采用基于中空纤维的灌注工艺，以优化细胞生长并提高病毒滴度。该病毒由 EB66® 细胞生产，这些细胞在 34°C 或 37°C 的格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）中培养，当 MOI 为 0.001 时，在 2 天时 ZIKV 的滴度为 1.0×1010PFU/ml。其最佳接种细胞密度为 1.6×108细胞/mL，并根据在线测量的细胞浓度使用电容探针控制灌注速率，成功实现了该过程的自动化。与以前相比，总产量增加了三个数量级。这可以通过使用高细胞密度培养、EB66 细胞适应性种子病毒感染和基于中空纤维的灌注系统来解释。

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种通过蚊子传播的 A 型病毒，已感染全球数百万人。目前，该病毒已在昆虫细胞系中成功生产。Pijlman 等人优化了 DASGIP® 生物反应器，并确定 BACe56-CHIKV 重组病毒的最佳 MOI 为 0.01 TCID50，最佳接种细胞密度为 2×106 细胞 /mL，最佳收获时间约为 52 hpi，基孔肯雅病毒样颗粒（VLP）的浓度为 2.1 mg/L。但另一项完全不同的研究从 Vero 细胞中获得基孔肯雅病毒，Ramya 等人在生物反应器中培养 4×105细胞 /mL 细胞后，将病毒接种到细胞中，最终获得 1.4×109PFU/ml 的病毒滴度。目前的研究重点是利用重组病毒开发基孔肯雅病毒疫苗，关于生物反应器技术优化过程的研究仍然很少。但昆虫细胞为上游工艺提供了更多选择。

对于埃博拉病毒，最有效的候选疫苗是 rVSV-ZEBOV。Gélinas 等人建立了一个 3.5 L 搅拌罐生物反应器，将 HEK293SF 细胞置于 HyClone HyCell TransFx-H 培养基中，温度为 34°C，以 MOI 0.001 感染。感染时，细胞计数为 1.16×106 细胞 /mL，生产结束时为1.8×106细胞/mL。在36 hpi时，滴度达到 1.19×108TCID50/ml 和 50 TCID50/VG。然而，Kiesslich 等人使用新的固定床生物反应器 scale-X hydro 在 34°C 和 DO50% 的条件下生产 rVSV-ZEBOV。在 VP-SFM 培养基中生长，最大细胞密度高达 271605 个细胞/cm²。当以 MOI=0.01 感染时，在 24 hpi 时最大感染滴度为 1.95×107TCID50/mL，病毒基因组与感染滴度的比例仅为 101 VG/TCID50。与微载体系统相比，感染性颗粒的细胞特异性生产力增加了 1.9 倍，但每个细胞的总病毒颗粒生产力下降了 5.9 倍。为了提高感染滴度，他们分别在 IHM03 和 MDXK 培养基中，在无血清培养基中培养的 Vero 细胞中生产 rVSV-ZEBOV，并在相同环境中培养。在 IHM03 生物反应器中以 MOI 0.01 感染时，感染滴度为 1.05×107TCID50/mL，当细胞密度为 4×108个细胞/mL 时，滴度为 1.32×108TCID50/ml。然而，悬浮适应的 Vero 细胞比 MDCK 更适合感染，细胞密度为1.02×106个细胞/mL，最大感染滴度为 3.87×107TCID50/mL，细胞特异性生产力为 37.9 TCID50/细胞，总病毒颗粒与感染颗粒的比例为282 VG/TCID50。在类似的培养环境条件下，随着生物反应器的改进，rVSV-ZEBOV 的产量和感染滴度显著增加。

（四）肠道病毒

肠道病毒 71 型感染可引起手足口病（HFMD）。2016 年在中国上市的 EV71 疫苗用于预防 EV71 感染引起的手足口病。目前的 EV71 疫苗候选物是通过转鼓瓶或细胞工厂技术在 Vero 细胞中培养的病毒生产的，因为这些技术易于实施和操作。由于上述技术劳动密集型，需要更高效、更经济的 EV71 生产工艺。微载体生物反应器技术可以为大规模生产提供途径，并提高病毒生产的效价。Chen 等人使用带有聚合物纤维载体的新型微型生物反应器（Amprotein Inc.，浙江中国），在最佳 MOI 为0.1 和最佳温度为32°C的条件下，感染3天后最大病毒滴度达到 1.0×108/ml，上清液总体积为 25 L，病毒总产量为 1.93×1012。他们创建了一种新的 EV71 生产培养模型结构和方法。使用该模型系统，可以快速且经济地生产手足口病疫苗。另一方面，Cytodex1 微载体广泛用于 EV71 的生产。例如，Liu 等人通过微载体融合生物反应器培养提高了 EV71 疫苗的产量。与单批培养相比，多收获半批（MHSBC）或灌注培养可显著提高 EVA71 病毒产量 7-14 倍。结果还表明，灌注技术比 MHSBC 培养方法更具优势，培养基更换策略可以减缓 CPE 的发生，提高 EVA71 病毒的产量。Wu 等人使用 200 L 无血清微载体生物反应器系统在 37℃、pH=6.8-7.2、MOI=10-4 的条件下培养 EV71，感染 10 天后病毒滴度达到 107 TCID50/mL，建立了灭活 EV71 病毒的大规模疫苗平台。这些研究为开发用于生产灭活 EV71 疫苗的大规模微载体细胞培养工艺提供了有价值的信息。同时，培养基的选择是最终产量的限速步骤。在 EV71 候选疫苗的中试生产中，发现上游工艺中开发的 VP-SFM 是 Vero 细胞生长和 EV71 病毒生产的最佳培养基。

柯萨奇病毒 A16（CVA16）也是手足口病的主要病原体，但目前尚无安全有效的预防性 CVA16 疫苗。更复杂的是，EV71 病毒颗粒不会引发针对 CVA16 的交叉反应中和抗体。因此，有必要开发基于 Vero 细胞全病毒生产的候选 CVA16 疫苗。基于大规模病毒培养技术的优势，Chen 等人将 Vero 细胞置于聚合物纤维载体上，并提供含有 0.5%（w/w）乳清蛋白水解物的无血清培养基，使用一次性 Bioflo310 和氨蛋白电流灌注生物反应器监测病毒感染和 Vero 细胞培养。经过这种优化后，最终病毒滴度达到 7.8×107TCID50/ml。这项研究表明，纤维载体的低剪切速率和摩擦力可以进一步减少病毒对细胞的细胞病变效应，因此比其他微载体更好。此外，这些研究还将促进利用在非织造聚合物纤维纸上生长的细胞培养物大规模生产灭活 CVA16 疫苗。

（五）狂犬病病毒

狂犬病是一种病毒性人畜共患病。狗是导致人类狂犬病死亡的主要原因，占所有传播给人类的狂犬病的 99%。源自细胞培养的狂犬病疫苗仍然是预防人类狂犬病的最安全和最有效的疫苗之一。Vero 细胞广泛用于狂犬病疫苗生产。生物反应器中的高密度细胞可以通过连续灌注培养不断收集病毒。例如，Rourou 等人在 2 L 生物反应器中研究了细胞增殖和病毒增殖的灌注培养，细胞密度达到 5×106/ml，病毒的最高滴度为 1.38×108个空斑形成单位（FFU）/mL，混合灭活病毒的滴度为 2.58 IU/ml。

近年来，Rourou 进一步在 Vero 细胞的悬浮培养中培养狂犬病病毒。该团队在 37°C、5% CO₂的摇瓶中建立了适应悬浮的 Vero 细胞（VeroS）的无血清培养系统。狂犬病病毒 LP-2061 株以 MOI 0.1 和细胞密度（8±0.5）×105个细胞 /mL 感染细胞，所有测试培养基的病毒滴度均高于107FFU/mL。与贴壁培养相比，VeroS 的病毒特异性生产力略有提高。这证明所获得的 VeroS 适用于生产高滴度狂犬病病毒，并为开发 VeroS 生物反应器生产狂犬病疫苗铺平了道路。然而，Vero 悬浮培养获得的病毒滴度仍然小于通过悬浮获得的病毒滴度。因此，Vero 细胞悬浮培养技术尚不成熟，需要进一步研究以提高细胞密度。此外，还应加强病毒生产下游工艺的优化，包括理化参数，对人二倍体细胞（HDCs）和狂犬病疫苗大规模生产的研究也应进行探索。

五、利用计算生物学模拟大规模上游工艺开发

从实验室模拟到工业大规模生产，上游生产必然存在差异，最直观的变化是生物反应器的规模（图 1A）。在 10,000 升以上规模的生物反应器制造活动中，如何维持细胞系在生物反应器中的长期稳定性是当前上游培养面临的最大问题。显然，直接进行大规模生产和优化是不现实的。将计算生物学应用于上游生产可以在很大程度上解决这一困境。通过计算机模拟整个培养过程，不断测试和优化各种参数，建立最佳模型，理论上可以实现低成本、高效率的工业上游生产。

Ueki 等人设计了一种具有相互混合特性的倒置混合生物反应器。他们使用计算流体动力学（CFD）模拟软件（FLUENT）分别计算反应器和旋转生物反应器的剪切应力和矢量，并分别使用非稳态和稳态分析。同时，建立了 κ-ε 模型进行比较。结果表明，倒置混合生物反应器的最大剪切应力和平均剪切应力显著低于传统旋转混合生物反应器。该生物反应器的应用可以大大减少细胞损伤，从而影响细胞的生理活性，最终提高最大细胞生长密度。

华东理工大学、同济大学和萨里大学提出使用高维模型表示（HDMR）来分析和模拟灌注生物反应器的全局敏感性。以 Contois 参数、乳酸米氏生长常数、葡萄糖最大消耗速率、葡萄糖最大浓度、氧气最大消耗速率、氧气最大浓度和细胞死亡动力学参数为输入参数，以葡萄糖浓度、氧气浓度、乳酸浓度、细胞密度和细胞生长为输出参数。他们建立了综合数学模型，并使用计算流体动力学软件（COMSOL MultiPhysitics v5.5）进行模拟。HDMR 的应用为细胞生长提供了合适的理化参数。另一个团队专注于细胞周期与培养环境变化之间的关系。基于基于代理的建模（ABM）方法，他们建立了一个模拟单个哺乳动物细胞生长及其循环调节以响应培养条件变化的模型。这种模型可以通过输入理化参数来预测细胞生长过程，其可靠性可以通过实验验证。

面对最近的新冠肺炎大流行，已经建立了一个数学模型来模拟腺病毒疫苗的生产。Ferreira 等人使用 SuperPro Designer v12 软件设计、建模和经济评估了新型冠状病毒载体疫苗的上游生产过程。结果表明，灌注培养方法产生的病毒滴度为 1×1012 VP/ml，最终疫苗剂量为每年 400 万剂。在本实验中，将计算生物学应用于疫苗生产，从理论上证明了腺病毒载体疫苗可以大规模、低成本生产。然而，该实验没有将疫苗开发的早期和晚期成本整合到整个建模系统中，这也是该模型的主要局限性。然而，它在一定程度上为腺病毒疫苗的开发提供了有价值的信息，并加快了疫苗研发进程。

总之，利用计算机软件模拟上游培养乃至疫苗生产的全过程有望成为未来的主流发展方向。尽管计算模型的引入可以最大限度地减少疫苗研发的资源消耗，但现有技术仍存在大量缺陷，导致理论值与实际值之间存在诸多偏差。工程级生物反应器计算模型发展的最大障碍是缺乏定量数据和物理模型。归根结底，人类对细胞的理解仍然太浅。目前，尽管计算生物学在模拟病毒生产和细胞培养方面取得了许多成就，但许多计算模型仍然停留在重建已知实验现象的水平。大多数模型被迫忽略复杂的细胞结构，直接模拟细胞状态，这在现实中与外部物体相互作用时会导致理论结果的显著偏差。因此，计算生物学需要与生物反应器进一步协调发展，以应对从实验室到工业规模上游生产差异带来的挑战。

六、结论

事实证明，疫苗供应是决定接种时间的关键因素，特别是在低收入和中等收入国家。为了实现高度流程密集型的病毒疫苗生产，实验室规模的研究为我们提供了大量数据和信息，帮助我们选择工艺和反应器。为了进一步优化大规模病毒疫苗生产，我们必须将这些大量数据与新工艺相结合，例如培养基的优化、新培养方案的探索、更高效和更安全的细胞系的研究以及自动化技术的进步。目前，最近开发的组合技术，如代谢组学、基因组学和蛋白质组学，可能有助于设计高细胞密度生长和病毒生成的技术。还可以通过在线监测底物和代谢物浓度直接控制进料或灌注速率。此外，随着计算生物学的发展，已有研究报道使用软件建立生物反应器系统模型来模拟和经济评估疫苗生产，这使得在面对新的传染病爆发时能够更快地开发新疫苗。因此，这些技术的快速发展和成熟对于高效、低成本的疫苗生产具有重要意义，代表了未来的重要研究方向。

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